基于cadR基因改造的全细胞传感器检测镉离子的研究

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近几年,镉污染的报道倍受关注,大米镉超标已威胁到广大人民群众的身体健康。现有的镉离子检测技术通常需要大型设备,操作复杂,耗时长,检测成本高,急需开发操作简便、快速有效和成本低的检测方法。本研究开发全细胞传感器检测镉离子的方法,为镉污染的快速检测提供技术支撑。  CadR是转录调控因子,当镉离子与其结合时,将启动特定的转录表达过程。但CadR还对其他一些重金属离子产生响应。基于这些情况,本研究构建了三个全细胞传感器并建立了镉离子检测方法。  首先,基于CadR蛋白的基本结构特点,对CadR蛋白进行了片段删节设计,即在CadR的C端删减10个和21个氨基酸,分别获得CadR-TC10和CadR-TC21蛋白。而后在DNA分子水平上,通过对C端引物的设计后,以PCR扩增的方式分别获得cadR,cadR-TC10和cadR-TC21基因片段,通过双酶切和连接反应获得重组传感器质粒,转化进入E.coliTOP10后获得本实验所需的三株大肠杆菌全细胞生物传感器COG、COG-TC10和COG-TC21。通过验证PCR的检验,结果表明构建成功。三个传感器经过镉离子溶液的诱导后,在紫外光的激发下,可发射出荧光,成功实现对镉离子的响应。  通过实验获得了COG的生长曲线,其中在0小时至2小时的培养时间内是调整期,2小时至10小时是对数生长期,稳定期在10小时至14小时,14小时后进入衰亡期。进而通过文献对比和实验,建立了检测流程和检测条件:①在M9补充培养基中,37℃、220 rpm震荡过夜培养,活化菌株;②按1%的量接种,在相同的条件下再培养;③培养到对数期早期(OD600在0.6至0.8之间);④将菌液稀释到OD600为0.1;⑤上样,样品pH范围在4.5至8.1之间;诱导,在30℃条件下诱导4小时;⑥测定荧光强度。  对比研究表明,以改造后的CadR为基础构建的传感器具有更高的特异性,COG-TC10和COG-TC21对锌离子的响应能力降低,相比于COG,分别下降了95%和85.6%,同时保持了相对较强的镉离子和汞离子的响应能力。三个传感器对锌离子、镉离子和汞离子的响应范围和最适检测范围分别为:COG:1.1-5000μM(75-5000μM),2-250μM(5-100μM),1-7.5μM(1-5μM);COG-TC10:0.9-5000μM(75-2500μM),1.3-250μM(5-100μM)和1.6-7.5μM(1-5μM); COG-TC21:1.2-5000μM(50-2500μM),1.5-250μM(5-100μM)和3.8-7.5μM(0.75-7.5μM)。  以市场销售大米为样本,ICP-MS的检测结果显示镉含量1.28 mg/kg,超出国家食品安全标准限值的六倍。应用生物传感器对该样品进行检测,通过COG-TC10测得的荧光值与以ICP-MS测得结果为依据所计算得到荧光值接近,表明该方法能够有效检测大米的镉离子超标。
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