RBSDV和SRBSDV安徽分离物全基因组特征及SRBSDVmp基因的功能分析

来源 :安徽农业大学 | 被引量 : 2次 | 上传用户:b329066975
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近年来,水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV)和南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)引起的水稻黑条矮缩病和玉米粗缩病在安徽省各稻区以及玉米种植区危害日益严重,生产上仅凭症状难以区分两种病毒,本研究利用RT-PCR方法能够实现一次性检测和鉴定RBSDV和SRBSDV2种病毒。为了深入了解安徽省RBSDV和SRBSDV起源及演化关系,本研究克隆了2个RBSDV和1个SRBSDV安徽分离物S1-S10基因组各个组分并测定序列全长,以期明确RBSDV和SRBSDV安徽省分离物的分子变异以及遗传进化特征。另外,植物病毒从侵染位点径向运动到临近细胞是成功建立系统侵染的关键,而病毒编码的运动蛋白(MPs)即参与病毒的转运。目前,协助SRBSDV在植物细胞间转移的运动蛋白尚不明确,本研究拟构建SRBSDV3个基因的植物表达载体,初步鉴定SRBSDV可能编码的运动蛋白。对明确SRBSDV系统侵染的分子机制以及分析其他基因的功能奠定了基础。1安徽省RBSDV和SRBSDV的分子鉴定根据RBSDV和SRBSDV S9保守序列设计3个特异性引物,不仅可以从单独感染RBSDV或SRBSDV的水稻样本中分别扩增出1条大小不同的特异性条带,而且还可以从感染RBSDV和SRBSDV的混合水稻样本中一次性扩增出2条大小不同的特异性条带。从安徽省4个县市水稻田采集矮缩水稻样本,RT-PCR检测发现,庐江和郎溪水稻样本受到RBSDV侵染,怀宁和宣州水稻样本受到SRBSDV侵染。将特异性条带克隆和测序,序列分析表明,庐江、郎溪2个样本的核苷酸序列与RBSDV山东和浙江分离物S9部分片段序列相似性高达99.3%~99.8%,且与RBSDV的亲缘关系最近,说明庐江和郎溪样本感染的病毒是RBSDV的2个分离物;怀宁、宣州2个样本的核苷酸序列与SRBSDV山东和海南S9部分片段序列相似性高达99.5%,且与SRBSDV亲缘关系最近,说明怀宁和宣州样本感染的病毒是SRBSDV的2个分离物。2RBSDV和SRBSDV安徽分离物S1-S10全序列的测定及其序列分析采集安徽省萧县玉米粗缩病样、庐江县和怀宁县水稻黑条矮缩病样,提取总RNA,设计特异性引物扩增了2个RBSDV安徽分离物以及1个SRBSDV安徽分离物(RBSDV-MX8,RBSDV-LJ,SRBSDV-HN2)全基因组序列,3个分离物S1-S10全基因组序列全长分别为29141nts、29142nts和29121nts。将RBSDV和SRBSDV安徽分离物S1-S10分别与斐济病毒属其他成员以及同种病毒分离物间进行序列比对,结果发现,RBSDV和SRBSDV与斐济病毒属其他成员S1-S10相似性分别为26.3%~84.8%、20.7%~74.8%、20.9%~99.5%、21.1%~99.5%、20.0%~99.5%、20.5%~99.6%、21.6%~100.0%、21.3%~99.8%、21.9%~99.7%和21.3%~99.8%,其中RBSDV分离物之间S1-S10相似性分别为53.1%~68.4%、65.3%~74.8%、72.2%~90.5%、94.6%~98.6%、93.3%~98.5%、91.6%~98.6%、93.7%~99.4%、94.0%~99.1%、88.6%~99.7%和93.2%~99.0%,SRBSDV分离物之间S1-S10相似性分别为83.3%~85.3%、67.8%~70.1%、80.5%~99.4%、97.5%~99.5%、98.3%~99.5%、97.4%~99.6%、99.1%~100.0%、98.9%~99.8%、98.6%~99.7%、98.7%和99.8%,RBSDV分离物与SRBDV分离物之间S1-S10的相似性分别为56.8%~75.3%、58.3%~68.9%、21.2%~23.6%、20.5%~22.1%、63.2%~65.8%、59.6%~62.8%、66.3%~67.2%、65.0%~67.8%、67.7%~70.2%和73.5%~75.9%。进一步构建S1-S10不同组分的系统关系树,RBSDV与SRBSDV分别聚成各自独立的分支,说明RBSDV和SRBSDV的亲缘关系较远。3SRBSDV mp基因的初步鉴定克隆SRBSDV S9-2、S7-2和S5-2基因,构建重组表达载体pBin-S9-2、pBin-S7-2和pBin-S5-2,分别与运动缺陷型PVX载体(pPVX-GUS-BSP)共轰击本氏烟叶片。 pBin-S7-2与pPVX-GUS-BSP共轰击本氏烟(Nicotianabenthamiana)叶片,组织化学染色后直接观察,可见蓝色斑点,在显微镜下观察,发现GUS基因编码的蛋白已扩展到多个细胞。而pBin-S9-2、pBin-S5-2分别与PVX-GUS-BSP共轰击本氏烟则观察不到蓝色斑点。说明pBin-S7-2在35S启动子驱动下能够互补PVX-GUS-BSP的运动功能,因此可以初步认为SRBSDVS7-2可能编码运动蛋白。
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