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本文从以下几方面进行论述：
第一部分我国两种优势种海蛇毒多组学比较分析
海蛇属蛇目眼镜蛇科海蛇亚科，全球共70余种，我国分布有17种，优势种为平颏海蛇（Hydrophis curtus,H.curtus）和青环海蛇（Hydrophis cyanocinctus,H.cyanocinctus），在北部湾及海南、福建近海最为多见。海蛇毒是由多种蛋白、多肽和小分子物质共同组成的混合物，其主要组分为神经毒素和多种酶类，致死性极强。由于海蛇种类、地域分布及猎食对象的不同，海蛇毒中所含的蛋白种类和占比也有一定差异。为了更好地研究我国海域平颏海蛇毒（H.curtusvenom，HcuV）和青环海蛇毒（H.cyanocinctusvenom，HcyV）的组成，比较分析两者差异情况，本部分以平颏海蛇和青环海蛇为研究对象，首先构建了海蛇毒腺转录组数据库；其次利用液相色谱-质谱联用技术，通过蛋白组学方法对两种海蛇毒的蛋白组成进行了比较分析；在组学基础之上，我们又进一步对海蛇毒相关的生物学性质进行了测定与分析。主要结果如下：
1.首先应用Illumina Hi Seq?平台对我国两种海蛇毒腺进行了转录组测序，成功构建了高质量的毒腺转录组数据库，平颏海蛇和青环海蛇毒腺分别获得38,710和35,716条unigenes序列。我们将毒腺的转录组数据在公共数据库（NR、KEGG、GO、KOG、SwissProt）中进行了功能注释，在NR数据库中，两种海蛇毒腺注释序列来源最多的3个物种均为Notechis scutatus,Pseudonaja textilis,Ophiophagus hannah；在KEGG注释中，平颏海蛇和青环海蛇毒腺分别注释了10,949和10,683条unigenes，主要集中在信号转导和疾病发生相关的路径中；对简单重复序列（simple sequence repeats，SSR）位点检测，平颏海蛇和青环海蛇毒腺转录组中分别发现了15,171和12,908个SSR位点，其中以单核苷酸为重复单元的类型占比最高，均超过了50%。通过与UniProt动物毒素库（UniProtanimal toxin and venom database）Blast比对，在两种海蛇毒腺中总共筛选到了17种蛇毒蛋白，充分挖掘了海蛇毒腺中蛇毒蛋白功能基因的资源。
2.通过液相色谱-质谱联用技术，获得HcuV和HcyV蛋白组分的原始肽段，匹配检索UniProt动物毒素数据库，在HcuV和HcyV中分别鉴定到47和38种毒素相关蛋白。根据功能分类，鉴定到的毒素相关蛋白可归为15个家族，主要包括：三指毒素、蛋白酶类、磷脂酶类、富含半胱氨酸毒素蛋白类、毒素因子、离子通道抑制剂等。这些毒素多见于蛇类，但也有少数见于其它有毒生物，包括蜘蛛（Lycosa singoriensis)、蝎子（Lychas mucronatus）、芋螺（Conus textile）等。
3.通过毒素蛋白组比较分析发现，不同毒素家族在HcuV和HcyV中所占比例不同，具体的蛋白组成也有一定差异。HcuV和HcyV中比例最高的两类毒素均为三指毒素（主要包括短链和长链神经毒素）和磷脂酶A2，在HcuV中所占比例分别为54%和38%，在HcyV中分别为69%和22%，与文献报道的不同海域海蛇毒的组成及占比有明显差异。两种海蛇毒的生物学活性测定结果表明，HcuV和HcyV的小鼠半数致死量（LD50）分别为0.34mg/kg和0.24mg/kg，都有很强的致死性；两种海蛇毒均检测到明显的神经毒性、磷脂酶A2活性，以及微弱的蛋白酶活性和间接溶血毒性，但无明显的促凝与抗凝活性，这些活性检测结果与组学分析结果相一致。
本部分通过对HcuV和HcyV进行多组学分析，并结合蛇毒生物学活性检测，揭示了我国两种优势种海蛇毒组成的分子多样性，也提示毒素蛋白组成比例的不同与其咬伤症状表现和致死效应之间可能存在的关系，为后续研制针对我国海域海蛇咬伤中毒的抗毒血清提供了重要基础。
第二部分抗平颏海蛇毒血清的制备及其抗毒效果评价
海蛇毒主要组分为神经毒素，能阻断神经突触传递，从而产生一系列中毒症状。海蛇毒的毒性极强，可诱发严重的呼吸衰竭，死亡率高，目前针对海蛇咬伤最有效的急救方式是尽快注射抗毒血清，但我国仅生产几种抗陆地蛇毒血清，对海蛇咬伤救治效果不佳。第一部分研究结果提示，不同海域、不同种类的海蛇，其毒素组成存在一定差异，因此有必要研制特异性针对我国海域优势种海蛇毒的抗毒血清，本论文第二部分即以我国海域优势种平颏海蛇毒为抗原，经过抗原处理、免疫马匹、抗体纯化等步骤，制备了高效价的抗毒血清；并进一步对抗海蛇毒血清的体内外抗毒效果进行了评价，明确了抗毒血清的有效用量和使用时机，为今后临床应用提供了参考。主要结果如下：
1.采用0.6%甲醛浓度灭活毒素再添加弗氏不完全佐剂进行乳化，使毒素抗原获得最大的免疫原性，免疫马匹后50天采血可获得最高效价的马血清；经过酶消化、硫酸铵沉淀、超滤、柱层析等抗体纯化步骤后，抗海蛇毒血清中抗体F(ab’)2蛋白纯度达到91.6%，杂质大量减少，同时具备较好的毒素中和能力。
2.抗平颏海蛇毒血清（H.curtusantivenom，HcuAV）体外抗毒实验结果显示，HcuAV对平颏海蛇毒和青环海蛇毒均有良好中和效果：1mL HcuAV能够对抗1.2mg平颏海蛇毒或0.9mg青环海蛇毒，使半数实验动物存活，提示HcuAV能交叉中和多种海蛇毒，并为体内实验的抗毒血清用量提供了依据。
3.HcuAV体内抗毒实验结果显示，海蛇咬伤中毒后注射HcuAV能显著提高实验动物的存活率，但需在短时间内（出现中毒症状前）尽早注射足量抗毒血清才能达到较好的救治效果，预防用药和延迟用药均无法降低中毒死亡率。同时，HcuAV能有效减轻海蛇毒造成的多器官病理学变化。
本部分以平颏海蛇毒为抗原，制备了高效价、高纯度的抗平颏海蛇毒马血清，能有效中和HcuV和HcyV，覆盖我国海域优势种海蛇毒。海蛇咬伤后尽快注射足量抗毒血清，能显著地降低中毒死亡率，保护机体脏器免受损伤，为今后抗海蛇毒血清的临床应用提供了实验依据。
第三部分平颏海蛇毒腺中活性组分的淘选与效应分析
海蛇毒由多种酶类、非酶类蛋白和多肽、小分子物质组成，是一类重要的海洋生物毒素。海蛇毒除了剧烈的毒性之外，也含有多种结构特异、功能新颖的活性物质，具有多样的药理学效应如：镇痛、抗炎、抗肿瘤、抗血栓等。海蛇毒中的活性物质是海洋生物资源开发研究的热点之一。
本部分以我国南海海域平颏海蛇为研究对象，分离其毒腺组织，利用M13噬菌体展示技术构建了平颏海蛇毒腺M13噬菌体展示文库。然后以内毒素LPS为靶标分子，经过多轮淘选，筛选出一个高亲和力的噬菌体克隆，通过基因测序、氨基酸序列预测与性质分析等，最终通过化学合成法获得了一段功能性多肽，并通过体内、体外实验评价其对内毒素的拮抗效果。本部分主要结果如下：
1.构建了高质量的平颏海蛇毒腺M13噬菌体展示文库，文库库容达到2.2×109，随机测序验证外源插入片段准确无误；c-Myc标签检测结果表明，外源插入片段在噬菌体外壳表面得到了高效的展示。
2.以LPS为靶标分子，经过4轮固相淘选、阳性克隆测序、氨基酸序列预测等过程，获得了一段平颏海蛇毒腺来源的21肽。多肽性质分析结果表明，该多肽富含碱性氨基酸，理论分子量为2523.15，理论等电点为10.76，在中性溶液中携带正电荷；该多肽的二级结构主要为α-螺旋，氨基与羧基端呈现出双亲性结构，能够与带负电荷疏水性的LPS特异性结合。
3.通过化学合成方式成功合成并纯化了该21肽，纯度超过95%，质谱测定实际分子量与软件预测的理论值相符，证明合成的多肽无误，可用于进一步实验。利用生物膜干涉技术（BLI）对该多肽与LPS的结合力进行测定，结果表明，该多肽与LPS具有较强的结合能力，结合方式为“快结合-慢解离”。内毒素中和实验表明，该海蛇毒腺来源的21肽具有明确的内毒素中和效果，因而将其命名为H.curtus Endotoxin-neutralizing Peptide，简称Hc-ENP。
4.体外实验结果表明，Hc-ENP具有明确的LPS拮抗效果，在5-10μg/mL浓度下，能够有效抑制LPS与RAW264.7细胞的结合。Western-blot、ELISA、细胞免疫荧光等结果显示，Hc-ENP能通过抑制MAPK、NF-κB炎性信号通路的激活，从而有效抑制LPS刺激细胞产生的一系列炎性反应，包括：炎性因子释放、炎性相关酶表达量升高、活性氧含量增加等，进而发挥抗炎活性。
5.体内实验结果表明，Hc-ENP能够有效抑制LPS刺激机体引发的全身性炎性反应，包括：靶器官炎性细胞浸润、血清炎性因子水平升高、器官组织中炎性相关酶表达量升高、组织病理改变等。
本部分通过构建高质量海蛇毒腺M13噬菌体展示库来进行淘选，从而获得平颏海蛇毒腺中的特定活性分子。本实验中我们获得了一个平颏海蛇毒腺来源的内毒素中和肽—Hc-ENP，其在体内外均有明确的LPS拮抗效果，本研究为进一步开发利用海蛇基因资源，探索其开发应用价值提供了新的途径。
第一部分我国两种优势种海蛇毒多组学比较分析
海蛇属蛇目眼镜蛇科海蛇亚科，全球共70余种，我国分布有17种，优势种为平颏海蛇（Hydrophis curtus,H.curtus）和青环海蛇（Hydrophis cyanocinctus,H.cyanocinctus），在北部湾及海南、福建近海最为多见。海蛇毒是由多种蛋白、多肽和小分子物质共同组成的混合物，其主要组分为神经毒素和多种酶类，致死性极强。由于海蛇种类、地域分布及猎食对象的不同，海蛇毒中所含的蛋白种类和占比也有一定差异。为了更好地研究我国海域平颏海蛇毒（H.curtusvenom，HcuV）和青环海蛇毒（H.cyanocinctusvenom，HcyV）的组成，比较分析两者差异情况，本部分以平颏海蛇和青环海蛇为研究对象，首先构建了海蛇毒腺转录组数据库；其次利用液相色谱-质谱联用技术，通过蛋白组学方法对两种海蛇毒的蛋白组成进行了比较分析；在组学基础之上，我们又进一步对海蛇毒相关的生物学性质进行了测定与分析。主要结果如下：
1.首先应用Illumina Hi Seq?平台对我国两种海蛇毒腺进行了转录组测序，成功构建了高质量的毒腺转录组数据库，平颏海蛇和青环海蛇毒腺分别获得38,710和35,716条unigenes序列。我们将毒腺的转录组数据在公共数据库（NR、KEGG、GO、KOG、SwissProt）中进行了功能注释，在NR数据库中，两种海蛇毒腺注释序列来源最多的3个物种均为Notechis scutatus,Pseudonaja textilis,Ophiophagus hannah；在KEGG注释中，平颏海蛇和青环海蛇毒腺分别注释了10,949和10,683条unigenes，主要集中在信号转导和疾病发生相关的路径中；对简单重复序列（simple sequence repeats，SSR）位点检测，平颏海蛇和青环海蛇毒腺转录组中分别发现了15,171和12,908个SSR位点，其中以单核苷酸为重复单元的类型占比最高，均超过了50%。通过与UniProt动物毒素库（UniProtanimal toxin and venom database）Blast比对，在两种海蛇毒腺中总共筛选到了17种蛇毒蛋白，充分挖掘了海蛇毒腺中蛇毒蛋白功能基因的资源。
2.通过液相色谱-质谱联用技术，获得HcuV和HcyV蛋白组分的原始肽段，匹配检索UniProt动物毒素数据库，在HcuV和HcyV中分别鉴定到47和38种毒素相关蛋白。根据功能分类，鉴定到的毒素相关蛋白可归为15个家族，主要包括：三指毒素、蛋白酶类、磷脂酶类、富含半胱氨酸毒素蛋白类、毒素因子、离子通道抑制剂等。这些毒素多见于蛇类，但也有少数见于其它有毒生物，包括蜘蛛（Lycosa singoriensis)、蝎子（Lychas mucronatus）、芋螺（Conus textile）等。
3.通过毒素蛋白组比较分析发现，不同毒素家族在HcuV和HcyV中所占比例不同，具体的蛋白组成也有一定差异。HcuV和HcyV中比例最高的两类毒素均为三指毒素（主要包括短链和长链神经毒素）和磷脂酶A2，在HcuV中所占比例分别为54%和38%，在HcyV中分别为69%和22%，与文献报道的不同海域海蛇毒的组成及占比有明显差异。两种海蛇毒的生物学活性测定结果表明，HcuV和HcyV的小鼠半数致死量（LD50）分别为0.34mg/kg和0.24mg/kg，都有很强的致死性；两种海蛇毒均检测到明显的神经毒性、磷脂酶A2活性，以及微弱的蛋白酶活性和间接溶血毒性，但无明显的促凝与抗凝活性，这些活性检测结果与组学分析结果相一致。
本部分通过对HcuV和HcyV进行多组学分析，并结合蛇毒生物学活性检测，揭示了我国两种优势种海蛇毒组成的分子多样性，也提示毒素蛋白组成比例的不同与其咬伤症状表现和致死效应之间可能存在的关系，为后续研制针对我国海域海蛇咬伤中毒的抗毒血清提供了重要基础。
第二部分抗平颏海蛇毒血清的制备及其抗毒效果评价
海蛇毒主要组分为神经毒素，能阻断神经突触传递，从而产生一系列中毒症状。海蛇毒的毒性极强，可诱发严重的呼吸衰竭，死亡率高，目前针对海蛇咬伤最有效的急救方式是尽快注射抗毒血清，但我国仅生产几种抗陆地蛇毒血清，对海蛇咬伤救治效果不佳。第一部分研究结果提示，不同海域、不同种类的海蛇，其毒素组成存在一定差异，因此有必要研制特异性针对我国海域优势种海蛇毒的抗毒血清，本论文第二部分即以我国海域优势种平颏海蛇毒为抗原，经过抗原处理、免疫马匹、抗体纯化等步骤，制备了高效价的抗毒血清；并进一步对抗海蛇毒血清的体内外抗毒效果进行了评价，明确了抗毒血清的有效用量和使用时机，为今后临床应用提供了参考。主要结果如下：
1.采用0.6%甲醛浓度灭活毒素再添加弗氏不完全佐剂进行乳化，使毒素抗原获得最大的免疫原性，免疫马匹后50天采血可获得最高效价的马血清；经过酶消化、硫酸铵沉淀、超滤、柱层析等抗体纯化步骤后，抗海蛇毒血清中抗体F(ab’)2蛋白纯度达到91.6%，杂质大量减少，同时具备较好的毒素中和能力。
2.抗平颏海蛇毒血清（H.curtusantivenom，HcuAV）体外抗毒实验结果显示，HcuAV对平颏海蛇毒和青环海蛇毒均有良好中和效果：1mL HcuAV能够对抗1.2mg平颏海蛇毒或0.9mg青环海蛇毒，使半数实验动物存活，提示HcuAV能交叉中和多种海蛇毒，并为体内实验的抗毒血清用量提供了依据。
3.HcuAV体内抗毒实验结果显示，海蛇咬伤中毒后注射HcuAV能显著提高实验动物的存活率，但需在短时间内（出现中毒症状前）尽早注射足量抗毒血清才能达到较好的救治效果，预防用药和延迟用药均无法降低中毒死亡率。同时，HcuAV能有效减轻海蛇毒造成的多器官病理学变化。
本部分以平颏海蛇毒为抗原，制备了高效价、高纯度的抗平颏海蛇毒马血清，能有效中和HcuV和HcyV，覆盖我国海域优势种海蛇毒。海蛇咬伤后尽快注射足量抗毒血清，能显著地降低中毒死亡率，保护机体脏器免受损伤，为今后抗海蛇毒血清的临床应用提供了实验依据。
第三部分平颏海蛇毒腺中活性组分的淘选与效应分析
海蛇毒由多种酶类、非酶类蛋白和多肽、小分子物质组成，是一类重要的海洋生物毒素。海蛇毒除了剧烈的毒性之外，也含有多种结构特异、功能新颖的活性物质，具有多样的药理学效应如：镇痛、抗炎、抗肿瘤、抗血栓等。海蛇毒中的活性物质是海洋生物资源开发研究的热点之一。
本部分以我国南海海域平颏海蛇为研究对象，分离其毒腺组织，利用M13噬菌体展示技术构建了平颏海蛇毒腺M13噬菌体展示文库。然后以内毒素LPS为靶标分子，经过多轮淘选，筛选出一个高亲和力的噬菌体克隆，通过基因测序、氨基酸序列预测与性质分析等，最终通过化学合成法获得了一段功能性多肽，并通过体内、体外实验评价其对内毒素的拮抗效果。本部分主要结果如下：
1.构建了高质量的平颏海蛇毒腺M13噬菌体展示文库，文库库容达到2.2×109，随机测序验证外源插入片段准确无误；c-Myc标签检测结果表明，外源插入片段在噬菌体外壳表面得到了高效的展示。
2.以LPS为靶标分子，经过4轮固相淘选、阳性克隆测序、氨基酸序列预测等过程，获得了一段平颏海蛇毒腺来源的21肽。多肽性质分析结果表明，该多肽富含碱性氨基酸，理论分子量为2523.15，理论等电点为10.76，在中性溶液中携带正电荷；该多肽的二级结构主要为α-螺旋，氨基与羧基端呈现出双亲性结构，能够与带负电荷疏水性的LPS特异性结合。
3.通过化学合成方式成功合成并纯化了该21肽，纯度超过95%，质谱测定实际分子量与软件预测的理论值相符，证明合成的多肽无误，可用于进一步实验。利用生物膜干涉技术（BLI）对该多肽与LPS的结合力进行测定，结果表明，该多肽与LPS具有较强的结合能力，结合方式为“快结合-慢解离”。内毒素中和实验表明，该海蛇毒腺来源的21肽具有明确的内毒素中和效果，因而将其命名为H.curtus Endotoxin-neutralizing Peptide，简称Hc-ENP。
4.体外实验结果表明，Hc-ENP具有明确的LPS拮抗效果，在5-10μg/mL浓度下，能够有效抑制LPS与RAW264.7细胞的结合。Western-blot、ELISA、细胞免疫荧光等结果显示，Hc-ENP能通过抑制MAPK、NF-κB炎性信号通路的激活，从而有效抑制LPS刺激细胞产生的一系列炎性反应，包括：炎性因子释放、炎性相关酶表达量升高、活性氧含量增加等，进而发挥抗炎活性。
5.体内实验结果表明，Hc-ENP能够有效抑制LPS刺激机体引发的全身性炎性反应，包括：靶器官炎性细胞浸润、血清炎性因子水平升高、器官组织中炎性相关酶表达量升高、组织病理改变等。
本部分通过构建高质量海蛇毒腺M13噬菌体展示库来进行淘选，从而获得平颏海蛇毒腺中的特定活性分子。本实验中我们获得了一个平颏海蛇毒腺来源的内毒素中和肽—Hc-ENP，其在体内外均有明确的LPS拮抗效果，本研究为进一步开发利用海蛇基因资源，探索其开发应用价值提供了新的途径。