HPV对于大多数女性而言,是一过性感染,大约80%的女性一生之中至少要感染一次HPV,在其引起细胞发生异常改变之前可以通过人体自身免疫力将它完全清除,不会对健康构成危害,也无法进行检测据研究结果表明,自从首次在宫颈癌组织中发现了HPV,则证实大约15种高危基因型HPV持续感染宫颈可以导致宫颈癌,癌前损害以及3级宫颈上皮内瘤病变(CIN3)、原位腺癌(AIS)。伴随着现代基因工程技术的飞速发展,已经建立了很多种异源蛋白的表达系统。昆虫细胞-杆状病毒表达系统自二十世纪八十年代问世,至今已不断改进完善,是重组蛋白表达技术的重要组成部分。与哺乳细胞的表达系统相比,昆虫细胞的表达量高,培养方式多样,且安全性好,具有广泛的应用。本文着重研究在昆虫细胞表达系统中,病毒的不同病毒感染复数(MOI)、不同的细胞感染密度(DOI)、不同细胞收获时间(TOH)对与HPV16L1的表达的影响。HPV16L1的构建表达:通过PCR合成16L1的基因,按照去除核定位信号设计PCR引物扩增截短型HPV16型目的基因,测序无误后重组入杆状病毒表达系统穿梭质粒p Fast Bac TM1,将目的基因片段重组入Bacmid基因组,提取重组的Bacmid DNA,M13引物PCR鉴定正确,将重组的杆状病毒Bacmid-HPVL1用转染的方法转染sf9细胞大量感染昆虫细胞后获得P1,P1继续感染细胞获得P2,依次类推,获得大量P4代滴度稳定的毒种原液。在确定毒种能在昆虫细胞中稳定表达后,设计以下三个优化表达的实验,⑴对病毒不同感染复数(MOI)的摸索:将细胞的接种密度(DOI)定在2.5×106个/ml,加毒后的第72小时收获,用不同的病毒感染复数(MOI)分别在昆虫细胞中表达后,收获细胞进行SDS电泳鉴定,确定最佳的病毒MOI;⑵对不同的细胞感染密度(DOI)的摸索:选取病毒感染复数(MOI)为0.5,加毒后的第72小时收获,用不同的细胞的感染密度(DOI)中接种毒种,在昆虫细胞中表达后,收获细胞进行SDS电泳鉴定,确定最佳细胞感染密度(DOI);⑶对不同收获时间(TOH)的摸索:选取病毒感染复数(MOI)为0.5,细胞的感染密度(DOI)定在2.5×106个/ml,接毒后按时间段分别取样收获后进行SDS电泳鉴定,确定最佳的收获时间。通过上述三个优化实验后,确定HPV16L1在昆虫细胞-杆状病毒表达系统中的最佳表达参数,在病毒感染复数(MOI)为0.5,细胞感染密度(DOI)在2.5×106个/ml,在感染细胞后72小时收获,HPV16L1在昆虫细胞中的表达量可达到150μg/ml,大量表达后进行超速离心纯化,通过免疫小鼠获得血清,应用假病毒中和抗体实验来检验免疫原性。本文通过对HPV生产工艺的初步研究,对未来生物制品在工业上的生产放大有一定指导意义。