研究背景先天性唇腭裂(CL/P)是一种临床较为常见的先天缺陷性疾病,我国最新的数据统计显示:CL/P总体患病率为16.63/10000。CL/P不但影响患者的外形、营养、语言、听力、发育等生理内容,更重要的是影响了患者心理健康。客观上给社会和家庭造成了负担。根据是否伴有身体其他先天畸形,先天性唇腭裂常分为综合征型唇腭裂(SCL/P)和非综合征型唇腭裂(NSCL/P)两种。作为常见性状的NSCL/P,其发病与后天环境因素密切相关,其个体内在的遗传基础与环境因素交互起作用,而这种遗传机制涉及到多个基因,其遗传方式复杂。通过寻找CL/P的易感基因,有助于理解CL/P内在的发病机理,筛选CL/P的发生发展中起关键作用的基因,对于遗传咨询及特异性干预具有重要意义。干扰素调节因子-6(IRF6)基因作为迄今学者们研究最多的CL/P候选基因之一,其编码蛋白IRF6是口腔及颌面部发育的关键元素,已证实其突变可导致Van der Woude综合征(VWS )以及腘窝翼状胬肉综合征(PPS),此外,有学者认为IRF6基因的多态性与NSCL/P的发病有显著相关性,并认为单纯性唇裂或腭裂发生的12%的遗传因素可归因于IRF6基因的变异,已证实有IRF6基因突变的唇腭裂儿童家族中再发几率是常人的三倍。研究目的1.分析广东地区健康人IRF6基因结构;2.了解IRF6基因的变异在广东地区健康人中的分布特点;3.发现存在于广东地区唇腭裂患者IRF6基因编码区序列的致病位点;4.初步筛选出与广东地区非综合征型唇腭裂患者可能关联的SNP位点;5.为下一阶段的大样本实验提供研究基础。研究方法1.研究设计共分为以下三个实验部分:第一部分:广东地区健康人IRF6基因序列的测序研究第二部分:广东地区唇腭裂患者IRF6基因编码区序列特点分析第三部分:IRF6基因SNPs与广东地区非综合征唇腭裂相关性的初步探讨2.研究对象2.1健康人:本研究共收集13名无血缘关系的广东籍贯汉族健康人血液样本,男7例,女6例,具体纳入标准是:(l)所有研究对象均为中国广东籍贯汉族人群;(2)家族中均无唇腭裂患者;(3)无其它先天性疾病或先天畸形,无重要脏器疾病。2.2 CL/P患者:42例病例样本来自2009年1~6月就诊于广州市妇女儿童医疗中心五官病区的连续住院患者及部分患者双亲,均为广东籍。VWS综合征三人核心家庭1例(包括先证者及其患病母亲),NSCL/P患者共40例,其中包括1个CLP双生子家庭、1对单纯性腭裂(CPO)双生子、2个NSCL/P家庭。3.研究方法3.1全血DNA试剂盒提取基因组DNA;3.2目的片段扩增采用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)技术;3.3基因型分型采用直接测序法;3.4统计分析采用Hard-Weinberg Equilibrium平衡分析(H-W平衡)、病例-对照比较(Case-Control Comparisons)、Fisher精确检验法、相对危险度(odd ratio,OR)和95%可信区间(95% CI)。结果1.在广东地区健康人样本中共扩增IRF6基因片段总长度25016～25046bp,共10个外显子,其中外显子1、2和10的全部序列、以及外显子3的小部分和外显子9的大部分为非编码区。外显子共2215bp,编码区序列共1404bp,内含子部分由于不同个体重复序列长短不同而略有差别。2.向Genbank提交两条广东地区健康人IRF6基因序列,分别为:HQ875393、JF346417。3.在广东地区13个健康人样本的IRF6基因中共发现64个变异位点,均为NCBI dbSNP已报道的SNP位点,其中编码区存在两个变异位点,分别是c.459G>T和c.820G>A。所有变异位点均为二等位基因型。4.在广东地区CL/P患者IRF6基因编码区序列共检测到3个突变位点。其中459G>T和820G>A两种突变在正常对照及未患病双亲中均被检出,NSCL/P组与正常对照组之间无差异(P>0.05)。1234C>T仅在VWS综合征患者中检出,与国际已报道的致病性突变一致。5.rs2235375、rs2236909、rs2294408、rs2073487在NSCL/P与正常对照组之间有差异(P=0.044)。6.尚未能证明rs2235375 GG、rs2236909 TT、rs2294408 CC、rs2073487 AA为保护因素(OR的95%CI上限大于1);也尚未能证明rs2235375 CC、rs2236909 CC、rs2294408 TT、rs2073487 GG为危险因素(OR的95%CI下限小于1)。结论1.已向Genbank提交两条广东地区健康人IRF6基因序列:HQ875393、JF346417。2.在广东地区健康人IRF6基因中共发现64个SNP,其中编码区存在两个变异位点,分别是c.459G>T和c.820G>A。3.广东地区CL/P患者IRF6基因编码区存在三个突变:459G>T, 820G>A,1234C>T。4. IRF6基因外显子9的1234C>T突变可能是广东地区VWS患者的一个致病因素。5. rs2235375、rs2236909、rs2294408、rs2073487在NSCL/P与正常对照组之间有差异(P=0.044)。6.尚不能认为13个标签SNP的基因型中存在保护因素或危险因素。7.部分实验结果与文献中的情况有所差别,这可能由于样本来自非随机连续样本、以及样本量较小引起的统计偏差,有待加大样本进一步研究。