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成熟花粉是被子植物的雄配子体,花粉萌发和花粉管快速极性生长对于被子植物的双受精至关重要。在花粉萌发与花粉管导向胚珠的生长过程中,很多信号分子参与了这个过程,包括钙离子、磷酸肌醇、活性氧、一氧化氮等等。花粉管萌发和生长过程中有大量的跨膜离子流动,调节细胞的渗透压,钙离子在其中作为第二信使又起到了至关重要的作用,调控了这个过程中很多生理过程。钙调素类似蛋白(Calmodulin-likeproteins,CMLs)是一种传递型钙离子感受器,其序列与高度保守的钙调素有一定的相似性,胞内钙信号的改变会被其感知并传递到下游。前期研究表明CML25在花粉中大量表达,且通过调控花粉管质膜内向钾离子通道,正向调控花粉的正常萌发与花粉管的正常生长。本论文以此为基础,进行了酵母双杂交筛库并获得了其互作蛋白,期望进一步揭示CML25正向调控拟南芥花粉萌发和花粉管生长的分子途径和机制。该研究主要结果如下:(1)酵母筛库筛得了一个与CML25互作的蛋白——新生多肽结合复合体类 α 亚基蛋白 5(Nascent polypeptide-associated complex subunit alpha-like protein 5,NACA5)。后经过酵母双杂交验证发现二者在酵母系统内互作;进一步利用荧光双分子互补技术,间接证明了 CML25与NACA5在细胞水平上存在互作的关系;进一步利用免疫共沉淀技术,表明了 CML25与NACA5在生化水平上存在互作。(2)NACA5基因组全长为1421 bp,CDS区全长为630 bp,编码209个氨基酸,表达的蛋白分子量为22.78 kDa。NACA5蛋白具有NAC家族保守的NAC和UBA结构域,且与同家族其它成员的相似性很高,其中与NACA4的同源性最高为71.6%,与NACA1的同源性最低为53.6%。通过分析初步推测NACA5拥有NAC家族蛋白的一般功能。(3)通过实时定量PCR与Promoter+GUS染色的结果,发现NACA5在花粉中有一定的表达;进一步的亚细胞定位实验发现NACA5主要在细胞核与细胞质中表达,推测NACA5主要在细胞质与细胞核内发挥生理调控作用。(4)进一步拿到了NACA5的干扰株系和CRISPR敲除株系,进行了花粉的性状分析。发现NACA5表达降低后,花粉培养到一定时间后,表现出花粉萌发率升高,花粉管变长的性状,表明NACA5是花粉萌发和花粉管生长的负调控因子。(5)通过杂交,构建了 CML25与NACA5的双突变体,并进行了双突变体的花粉性状分析。发现在花粉萌发率方面,双突变体的性状与cml25的表型趋于一致;在花粉管长度方面,双突变体的性状也是与cml25的表型趋于一致。这从遗传学上证明NACA5位于CML25的上游并与CML25共同参与花粉萌发和花粉管生长过程。本论文的研究结果表明,拟南芥NACA5是CML25的互作蛋白,位于CML25的上游,负向调控拟南芥的花粉萌发和花粉管生长。该研究有利于进一步揭示CML25所在的信号调控通路,也有利于发现NACA5新的生物学功能。