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卵壳蛋白基因(Chorion protein,CP)是构建卵壳的重要基因,卵壳蛋白基因家族编码组成的卵壳蛋白占果蝇卵壳干重的95%以上。卵壳功能极为重要,它包裹在卵的表面保护卵免受外界环境的胁迫、进行必要的生存物质交换(如水分、气体、营养等)以及精子与卵结合通道等重要的生理功能。卵壳的行成发生在卵发育的14个阶段的末端,由CP基因控制表达的mRNA的形成或者消失来控制相应卵壳蛋白的表达。整个过程十分复杂,具有严格的时间、空间特异性。本文在首先FlyBase内筛选出卵壳蛋白相关基因,构建CP基因UAS-RNAi/Gal4杂交体系进行基因干扰(RNA interference,RNAi),通过统计分析各杂交株系的产卵能力以及卵孵化能力筛选出影响较为显著的杂交株系,并通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)确认其基因表达是否成功。然后拍摄观察CP基因RNAi卵表面微结构及形态、卵巢形态及卵巢小管发育状况,并电泳分离卵巢总蛋白、卵总蛋白,对比CP基因RNAi株系与亲本之间的蛋白表达差异。最后对所筛选出孵化率低于50%高于20%的CP基因RNAi株系的化蛹、羽化、寿命等发育过程进行探究。具体结果如下:(1)CP基因RNAi后产卵及孵化异常品系筛选与所选Gal4雌性亲本杂交后,阴性对照C15产卵数量均无显著变化,各CP基因株系、Mnn1基因(CP基因上游基因)、Knk(CP基因下游基因)阳性对照Cysp产卵数量降低显著(P<0.05),部分基因孵化率降低也显著。通过RT-qPCR技术,检测以Act-Gal4为雌性亲本进行杂交得到的F1代的基因表达含量,与RNAi亲本之间进行对比,所有RNAi后CP基因株系、Mnn1基因株系、Knk基因株系与C15基因株系和干扰后阳性对照基因(Cysp)株系的基因表达含量均显著下降(P<0.05)。所选孵化率低于50%高于20%的RNAi株系Byn--Gal4/Cysp-RNAi,Da-Gal4/Cysp-RNAi、Lsp2-Gal4/CP7Fa-RNAi、Lsp2-Gal4/Knk-RNAi、NGT40-Gal4/Cysp-RNAi、Pcog-Gal4/Cysp-RNAi与亲本对照,基因表达含量也都显著降低(P<0.05)。说明CP基因RNAi能够显著影响果蝇的产卵能力以及卵孵化能力。(2)CP基因RNAi后卵的细胞凋亡情况、形态及表面微结构变化。探究Da-Gal4/CP7Fa-RNAi(孵化率<10%)的卵发育情况发现,其卵发育异常,持续皱缩至完全失活无法正常孵化出幼虫。卵表面结构异常,组成正常卵表面六边形结构持续改变至不规则多变形。同时,卵壳结构异常影响卵的呼吸及水分和营养物质的交换。卵壳发育缺陷同样导致DAPI染液无法通过卵壳,因此无法观察到卵内细胞凋亡情况。但其荧光显色后显示结构与体式显微镜下所观察结果一致,推测卵内蛋白合成异常、卵表面结构发育异常导致卵无法进行呼吸以及水和营养物质的交换,从而导致卵发育异常,以致卵失活,无法完成孵化过程。推测CP基因能通过调节卵孵化能力影响果蝇的生长发育。(3)CP基因RNAi后卵巢的形态、结构变化及卵巢小管发育变化。探究Da-Gal4/CP7Fa-RNAi、Da-Gal4/Knk-RNAi(产卵量降低显著)的卵巢发育过程及卵巢小管数量发现,CP基因RNAi导致生殖干细胞发育受阻,使卵巢小管体积较小或者无法成型,同时期卵巢小管数量减少。同时,卵巢小管发育滞缓也使卵巢形态变小。说明CP基因能通过影响卵巢小管发育而影响果蝇的生殖能力、(4)CP基因RNAi的卵巢及卵的总蛋白表达变化。提取分离Da-Gal4/CP7Fa-RNAi、Da-Gal4/Knk-RNAi的卵蛋白及卵巢总蛋白,与亲本的卵蛋白及卵巢总蛋白进行对比,发现100kDa条带蛋白表达含量降低。本文通过质谱测序此条带分析了其中匹配率比较高的几种蛋白质,发现CP基因RNAi后能导致卵黄多肽含量、翻译延伸因子含量显著下降使卵及卵巢发育受影响,使卵孵化能力及果蝇产卵能力下降。(5)CP基因RNAi对果蝇化蛹、羽化、寿命的影响。探究孵化率低于50%高于20%的RNAi株系Byn--Gal4/Cysp-RNAi、Da-Gal4/Cysp-RNAi、Lsp2-Gal4/CP7Fa-RNAi、Lsp2-Gal4/Knk-RNAi、NGT40-Gal4/Cysp-RNAi、Pcog-Gal4/Cysp-RNAi发现,它们的化蛹率、羽化率显著降低(P<0.05),化蛹时间、羽化时间影响不显著(P>0.05),寿命影响不显著(P>0.05)。推测CP基因RNAi能够显著降低卵黄蛋白表达含量,使卵内发育受阻,无法成长成健康的个体,所以化蛹率及羽化率都显著降低。但是因为没有影响到自由基或者SOD、CAT产生通路,或者该通路具有冗余效应,并未产生达到影响CP基因RNAi株系寿命的突变量,所以CP基因RNAi对化蛹时间、羽化时间、成虫寿命影响不显著。综上所述,CP基因RNAi会使卵内黄多肽含量、翻译延伸因子含量、卵黄蛋白表达含量降低,导致卵巢发育异常,卵巢小管数量减少,使产卵能力降低。卵发育异常、卵表面微机构破坏、卵壳形成受阻,使卵孵化能力降低。同时,化蛹率、羽化率降低。推测没有影响到自由基或者SOD、CAT产生通路,或者该通路或CP基因RNAi具有冗余效应,对寿命影响不显著。