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鸡球虫属于顶复器原虫,钙依赖蛋白激酶（CDPKs）是顶复器原虫Ca2+信号通路中的重要效应分子,控制虫体的滑移运动、入侵细胞、虫体发育等重要的生理过程,CDPKs仅存在于植物、绿藻、纤毛虫及顶复器原虫中。由于宿主没有CDPKs,对球虫CDPKs的功能以及在Ca2+信号通路中的作用进行研究,将为开发新型抗球虫药物和研制球虫疫苗提供重要的分子依据。本研究在实验室前期工作的基础上,筛选柔嫩艾美耳球虫CDPK4（EtCDPK4）的潜在互作蛋白,对潜在互作蛋白的特性进行初步分析和相互作用进行验证。1.Co-IP、His pull down与质谱技术筛选Et CDPK4互作蛋白收集与纯化柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊（SO）,提取全蛋白,用Co-IP、His pull down与质谱技术筛选获得4个与EtCDPK4潜在互作的蛋白,分别为延伸因子1α（EtEF1α）、真核翻译起始因子5A（EteIF-5A）、吡咯啉-5-羧酸还原酶（EtPYCR）和14-3-3蛋白（Et14-3-3）。2.四个潜在互作蛋白基因的克隆、原核表达及生物信息学分析以柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA为模板,扩增了EtEF1α、EteIF-5A、EtPYCR和Et14-3-3基因的ORF序列,生物信息学分析显示,4个基因编码的氨基酸分别为450个、161个、173个和277个,预测分子质量为49.1 kDa、17.3 kDa、18.5 kDa和31.7 kDa,等电点为4.7、5.35、6.08和4.83;编码的蛋白均无信号肽和跨膜结构域,但都含有N-肉豆蔻酰化位点,推测这4个蛋白可能与EtCDPK4相互作用从而抑制虫体入侵。3.四个潜在互作蛋白基因的特性与功能初步分析用qRT-PCR和Western blot分析4个潜在互作蛋白基因在虫体的转录水平和蛋白翻译水平,结果显示EtEF1α在子孢子（Spz）和裂殖子（Mrz）的mRNA转录水平高于未孢子化卵囊（UO）和SO,翻译水平在UO和Mrz高表达;EteIF-5A在Mrz的mRNA转录水平最高,在UO的翻译水平最高;EtPYCR在UO的转录水平和翻译水平最高;Et14-3-3在SO和Spz的mRNA转录水平高于其他阶段,在UO的翻译水平最高。用间接免疫定位发现,EtEF1α和Et14-3-3主要定位于Spz一端和整个Mrz,EteIF-5A和EtPYCR主要定位于Spz顶端,随着虫体在细胞内发育,Et EF1α和EtPYCR荧光强度逐渐增强,Et14-3-3则逐渐减弱,而EteIF-5A在子孢子发育为滋养体时,荧光强度增强,未成熟裂殖体时,强度减弱,发育为成熟裂殖体后,强度增强。入侵抑制实验结果表明,兔抗rEteIF-5A、r EtPYCR和rEtEF1α多克隆抗体能有效抑制子孢子入侵DF-1细胞,抑制率分别达48%、58%,22%,而兔抗rEt14-3-3抗体无抑制效果。4.四个潜在互作蛋白与EtCDPK4互作的验证将4个重组真核表达质粒（pBiFC-VN155-EtEF1α、pBiFC-VN155-EteIF-5A、pBiFC-VN155-EtPYCR、pBiFC-VN155-Et14-3-3）分别与pBiFC-VC155-EtCDPK4共转染293T细胞,结果pBiFC-VN155-EteIF-5A、pBiFC-VN155-Et14-3-3与pBiFC-VC155-EtCDPK4共转染的细胞显示明显绿色荧光,而pBiFC-VN155-EtEF1α、pBiFC-VN155-Et PYCR与pBiFC-VC155-Et CDPK4共转染的细胞未显示绿色荧光,说明EteIF-5A、Et14-3-3与EtCDPK4之间存在互作,EtEF1α、EtPYCR与EtCDPK4无互作。对BiFC验证为阳性的2个蛋白,以兔抗r EtCDPK4血清中纯化的IgG作为诱饵蛋白,rEteIF-5A与rEt CDPK4、r Et14-3-3与rEtCDPK4分别作为猎物蛋白,Co-IP进行验证;再以r EteIF-5A或r Et14-3-3为诱饵蛋白,rEtCDPK4为猎物蛋白,用GST pull down进行验证。Co-IP和GST pull down结果都显示在相应位置出现特定蛋白条带,说明EteIF-5A、Et14-3-3与EtCDPK4存在相互作用,结果与BiFC一致。将2个阳性蛋白与EtCDPK4进行免疫共定位,发现EteIF-5A与EtCDPK4、Et14-3-3与EtCDPK4主要位于Spz和Mrz的表面,且虫体顶端荧光较强,说明二者可能在虫体入侵宿主细胞过程中发挥了协同作用。上述研究结果为深入探索EtCDPK4与互作蛋白的作用机理以及这些蛋白在球虫生活史过程中发挥的功能提供了基础数据。