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家蚕因能吐丝结茧而被列为重要的经济昆虫。蚕丝是一种天然的动物蛋白质纤维，中华民族的祖先早在公元前两千多年就开始利用蚕丝制作纺织服饰。自古以来，蚕丝制品以其华丽的外观、优雅的光泽、舒适的体感而被大众喜爱。近几十年来，研究者们发现蚕丝还具有可控的生物降解性、良好的生物相容性和较强的可塑性等优点，开启了蚕丝在生物医学材料、药物缓释载体、生物传感器和化妆品等领域的广阔应用空间。蚕丝独特的蛋白成分及成纤维过程是决定蚕丝优良特性的根本因素。因此，深入研究蚕丝蛋白各组分在成纤维过程中的作用，对于蚕丝产业的发展具有重要的指导作用。
目前的研究表明，蚕丝纤维化的过程实质上就是丝腺腔内丝蛋白构象转变，丝蛋白形态由液态转变为固态的过程。影响这个过程的因素有很多，比如：丝腺pH环境、金属离子、蛋白浓度以及剪切力。在这个过程中同样重要的因素还包括丝蛋白的组成成分。家蚕裸蛹品系Nd因丝素分泌异常只能形成丝胶茧，而丝素重链基因敲除后茧层变薄且类似于丝胶茧。此外，丝素蛋白缺失还会使蚕丝性能等方面发生异常。蚕丝中除丝素蛋白和丝胶蛋白等分子量高于100kDa的蛋白外，还有很多分子量低于20kDa的高丰度小分子量蛋白，如蛋白酶抑制剂和Seroins蛋白。BmSPI51蛋白是蚕丝中含量最大的蛋白酶抑制剂，而Seroin1蛋白是蚕丝中含量最大的Seroin类蛋白。尽管有研究发现蛋白酶抑制剂SPI51可以抑制胰蛋白酶活性，也发现了Seroin1蛋白有抑制细菌生长的活性，但一直未有充分的证据来阐释蚕丝中这两个重要的小分子蛋白的生物学功能。因此本研究选取SPI51和Seroin1这两个小分子丝蛋白作为研究对象，综合采用分子生物学、生物化学、材料力学以及基因编辑等多种技术手段对它们在丝腺内的成纤过程和在成纤后蚕茧中的功能进行了深入的研究。主要研究结果如下：
1.重要丝蛋白的表达模式分析
通过分析主要丝蛋白在转录水平以及蛋白水平的表达模式，绘制丝蛋白合成、转运、分泌的全过程。发现丝素蛋白基因仅在后部丝腺表达，且在五龄时期表达量逐渐增加，上簇前达到最大量。3种丝素基因转录水平的表达量比例为FibH：FibL：P25≈6：3：1，而蛋白水平比例则为6：6：1。发现3种丝胶蛋白都在中部丝腺表达，但表达模式有较大差别：Sericin1基因在五龄第3天以后的中部丝腺中部和中部丝腺后部表达，表达量逐渐增加；Sericin2基因在中部丝腺前部表达，在五龄时期表达量逐渐降低，第3天以后不再表达；Sericin3基因在五龄第5天以后的中部丝腺前部表达，表达量逐渐增加。蛋白酶抑制剂大多在中部丝腺前部表达，与蛋白酶抑制剂主要在蚕茧外围抑制病原菌这一功能相吻合；3个未知功能蛋白在中部丝腺特异表达，推测与丝胶蛋白的组装相关；Seroin1蛋白是蚕茧中唯一在丝腺各个区段都有表达的高丰度蛋白。综合来看，在后部丝腺特异表达的3种丝素蛋白形成了丝纤维；在中部丝腺特异表达的蛋白种类众多，包括丝胶蛋白、蛋白酶抑制剂和未知功能蛋白等，它们参与了丝胶的组装与分泌，保护丝蛋白不被降解等多个功能；而在中部丝腺和后部丝腺都有表达的Seroin蛋白可能具有更加复杂的多种功能。值得关注的是，BmSPI51基因与Seroin1基因在丝腺中的表达量非常高，且在中部丝腺和后部丝腺都有表达，暗示了它们功能的复杂性。因此我们对这两个小分子蛋白进行了深入的功能研究。
2.SPI51蛋白的抑菌功能研究
通过qRT-PCR和Westernblot对BmSPI51在丝腺中的表达模式进行分析，发现其在丝腺特异表达，且在中部丝腺前区的表达量最高。通过对五龄第3天家蚕注射酿酒酵母、白色念珠菌和球孢白僵菌进行诱导，发现BmSPI51基因在3种真菌分别诱导后第18h-24h的脂肪体中显著上调表达。通过对去除信号肽编码序列的BmSPI51进行克隆和原核表达，获得了在上清中大量表达的BmSPI51蛋白。对BmSPI51蛋白的抑酶活性进行检测，发现其对胰蛋白酶活性的抑制率可达100%，而对胰凝乳蛋白酶、蛋白酶K等蛋白酶不具有抑制活性。通过与3种真菌进行孵育，发现BmSPI51蛋白对3种真菌，酿酒酵母、白色念珠菌以及球孢白僵菌都具有良好的抑制活性。进一步对BmSPI51蛋白的抑制真菌机制进行研究，发现其能通过结合真菌细胞壁中的葡聚糖和甘露聚糖来抑制真菌孢子的生长。将商品化的大豆胰蛋白酶抑制剂(GmSTI)作为平行对照，发现BmSPI51蛋白对酿酒酵母和白色念珠菌的抑制活性显著强于GmSTI蛋白。
通过氨基酸序列分析，我们发现家蚕的BmSPI51蛋白与野蚕的同源蛋白WildSPI51在活性位点和C端序列存在差异。SPI51蛋白的活性位点P1-P5由野蚕的“RGGFR”突变成了家蚕的“KGSFP”，并且野蚕SPI51序列C端的9个氨基酸“YNTCECSCP”中的“Y”氨基酸编码序列突变后成为了终止密码子，导致家蚕BmSPI51翻译提前终止，缺失了9个氨基酸。我们构建了3个载体，包括BmSPI51-PPSUMO、BmSPI51+tail(tail为WildSPI51C端9个氨基酸)-PPSUMO、BmSPI51M-PPSUMO(M表示家蚕SPI51活性位点突变为野蚕的活性位点)。对这3种蛋白进行稳定性、抑酶和抑菌活性研究，发现它们的稳定性没有显著差异，但BmSPI51+tail蛋白和BmSPI51M蛋白抑制真菌的生长的能力显著强于BmSPI51蛋白。以上结果说明，野蚕SPI51活性位点和C端的9个氨基酸是导致野蚕SPI51蛋白抑菌活性更高的主要原因。
3.Seroin1蛋白参与家蚕丝腺核内复制进程
利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，实现了Seroin1基因在家蚕丝腺中的敲除。通过连续的基因组测序，选择缺失两个碱基形式的家蚕个体进行自交，筛选纯合个体。结果发现Seroin1基因被敲除后，整个丝腺变小，丝腺干重、湿重都显著降低，丝腺发育迟缓，特别是从五龄第3天开始丝腺发育明显停滞。我们通过两种方法分析了影响丝腺发育的原因：1、通过分析丝腺细胞的数量，发现与对照组相比没有明显变化；2、通过分析丝腺细胞的体积，发现Seroin1敲除后丝腺细胞的体积明显变小。以上结果表明丝腺变小的关键在于丝腺细胞体积的变小。提取Seroin1敲除品系(Seroin1-/-)的丝腺总DNA，发现与对照组的丝腺细胞DNA含量相比显著降低，到上簇时期仅为对照组的1/4左右。进一步利用5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷(EdU)来标记细胞周期中处于S期(DNA复制)的家蚕丝腺细胞，结果表明Seroin1-/-品系丝腺细胞中的DNA复制明显减弱。我们进一步检测了调控细胞周期关键基因的表达变化，发现Seroin1基因被敲除后，E2F1、cyclinE和CDK2显著上调。在BmE细胞上过表达Seroin1后，E2F1、cyclinE和CDK2显著下调，说明Seroin1确实可以影响E2F1、cyclinE和CDK2的表达量。总之，Seroin1基因被敲除后，细胞周期调控相关基因的表达量显著上调，从而使丝腺细胞的DNA复制进程放缓，导致丝腺细胞体积变小。
4.Seroin1蛋白参与家蚕泌丝行为
通过对敲除Seroin1基因的家蚕泌丝行为的调查，发现Seroin1-/-品系从蚁蚕开始丝纤维分泌量就少于正常家蚕，从三龄到五龄不再分泌丝纤维，导致形成裸蛹表型。观察上簇时期丝腺的形态，发现与正常家蚕相比较，Seroin1-/-品系的中部丝腺颜色变淡、内容物变软，丝腺腔内蛋白在受外力作用时不能形成丝纤维，表明导致Seroin1-/-品系不能吐丝的关键可能在于中部丝腺腔内蛋白的差异。将丝腺分为5个区段后进行切片，观察它们的横截面发现，与正常家蚕相比，Seroin1-/-品系丝腺腔内蛋白没有丝胶层。经qRT-PCR检测和蛋白质组学的分析，我们发现丝胶层蛋白的表达量显著下降，使Seroin1-/-品系丝腺腔内只有丝素蛋白而无丝胶层蛋白。在缺失丝胶层蛋白的情况下，Seroin1-/-品系的丝素蛋白仍然泳动到了前部丝腺，但是却无法分泌到吐丝口之外。利用红外光谱仪分析丝腺腔内蛋白后发现，Seroin1-/-品系丝腺腔内蛋白二级结构发生了很大的变化，无规则卷曲和α-螺旋结构显著增加，而β-折叠和β-转角含量显著下降。通过流变学分析发现，敲除Seroin1基因后的丝腺腔内蛋白与对照相比拥有更低的黏度，初始储能模量与对照相比也更低，且在动态应变扫描过程中的屈服点比对照提前很多。这些结果表明Seroin1-/-品系丝腺腔内的丝蛋白结构更容易受到破坏，即丝胶层对丝素具有重要的保护作用，同时，在缺乏丝胶层蛋白的情况下丝素蛋白将不能正确折叠。
目前的研究表明，蚕丝纤维化的过程实质上就是丝腺腔内丝蛋白构象转变，丝蛋白形态由液态转变为固态的过程。影响这个过程的因素有很多，比如：丝腺pH环境、金属离子、蛋白浓度以及剪切力。在这个过程中同样重要的因素还包括丝蛋白的组成成分。家蚕裸蛹品系Nd因丝素分泌异常只能形成丝胶茧，而丝素重链基因敲除后茧层变薄且类似于丝胶茧。此外，丝素蛋白缺失还会使蚕丝性能等方面发生异常。蚕丝中除丝素蛋白和丝胶蛋白等分子量高于100kDa的蛋白外，还有很多分子量低于20kDa的高丰度小分子量蛋白，如蛋白酶抑制剂和Seroins蛋白。BmSPI51蛋白是蚕丝中含量最大的蛋白酶抑制剂，而Seroin1蛋白是蚕丝中含量最大的Seroin类蛋白。尽管有研究发现蛋白酶抑制剂SPI51可以抑制胰蛋白酶活性，也发现了Seroin1蛋白有抑制细菌生长的活性，但一直未有充分的证据来阐释蚕丝中这两个重要的小分子蛋白的生物学功能。因此本研究选取SPI51和Seroin1这两个小分子丝蛋白作为研究对象，综合采用分子生物学、生物化学、材料力学以及基因编辑等多种技术手段对它们在丝腺内的成纤过程和在成纤后蚕茧中的功能进行了深入的研究。主要研究结果如下：
1.重要丝蛋白的表达模式分析
通过分析主要丝蛋白在转录水平以及蛋白水平的表达模式，绘制丝蛋白合成、转运、分泌的全过程。发现丝素蛋白基因仅在后部丝腺表达，且在五龄时期表达量逐渐增加，上簇前达到最大量。3种丝素基因转录水平的表达量比例为FibH：FibL：P25≈6：3：1，而蛋白水平比例则为6：6：1。发现3种丝胶蛋白都在中部丝腺表达，但表达模式有较大差别：Sericin1基因在五龄第3天以后的中部丝腺中部和中部丝腺后部表达，表达量逐渐增加；Sericin2基因在中部丝腺前部表达，在五龄时期表达量逐渐降低，第3天以后不再表达；Sericin3基因在五龄第5天以后的中部丝腺前部表达，表达量逐渐增加。蛋白酶抑制剂大多在中部丝腺前部表达，与蛋白酶抑制剂主要在蚕茧外围抑制病原菌这一功能相吻合；3个未知功能蛋白在中部丝腺特异表达，推测与丝胶蛋白的组装相关；Seroin1蛋白是蚕茧中唯一在丝腺各个区段都有表达的高丰度蛋白。综合来看，在后部丝腺特异表达的3种丝素蛋白形成了丝纤维；在中部丝腺特异表达的蛋白种类众多，包括丝胶蛋白、蛋白酶抑制剂和未知功能蛋白等，它们参与了丝胶的组装与分泌，保护丝蛋白不被降解等多个功能；而在中部丝腺和后部丝腺都有表达的Seroin蛋白可能具有更加复杂的多种功能。值得关注的是，BmSPI51基因与Seroin1基因在丝腺中的表达量非常高，且在中部丝腺和后部丝腺都有表达，暗示了它们功能的复杂性。因此我们对这两个小分子蛋白进行了深入的功能研究。
2.SPI51蛋白的抑菌功能研究
通过qRT-PCR和Westernblot对BmSPI51在丝腺中的表达模式进行分析，发现其在丝腺特异表达，且在中部丝腺前区的表达量最高。通过对五龄第3天家蚕注射酿酒酵母、白色念珠菌和球孢白僵菌进行诱导，发现BmSPI51基因在3种真菌分别诱导后第18h-24h的脂肪体中显著上调表达。通过对去除信号肽编码序列的BmSPI51进行克隆和原核表达，获得了在上清中大量表达的BmSPI51蛋白。对BmSPI51蛋白的抑酶活性进行检测，发现其对胰蛋白酶活性的抑制率可达100%，而对胰凝乳蛋白酶、蛋白酶K等蛋白酶不具有抑制活性。通过与3种真菌进行孵育，发现BmSPI51蛋白对3种真菌，酿酒酵母、白色念珠菌以及球孢白僵菌都具有良好的抑制活性。进一步对BmSPI51蛋白的抑制真菌机制进行研究，发现其能通过结合真菌细胞壁中的葡聚糖和甘露聚糖来抑制真菌孢子的生长。将商品化的大豆胰蛋白酶抑制剂(GmSTI)作为平行对照，发现BmSPI51蛋白对酿酒酵母和白色念珠菌的抑制活性显著强于GmSTI蛋白。
通过氨基酸序列分析，我们发现家蚕的BmSPI51蛋白与野蚕的同源蛋白WildSPI51在活性位点和C端序列存在差异。SPI51蛋白的活性位点P1-P5由野蚕的“RGGFR”突变成了家蚕的“KGSFP”，并且野蚕SPI51序列C端的9个氨基酸“YNTCECSCP”中的“Y”氨基酸编码序列突变后成为了终止密码子，导致家蚕BmSPI51翻译提前终止，缺失了9个氨基酸。我们构建了3个载体，包括BmSPI51-PPSUMO、BmSPI51+tail(tail为WildSPI51C端9个氨基酸)-PPSUMO、BmSPI51M-PPSUMO(M表示家蚕SPI51活性位点突变为野蚕的活性位点)。对这3种蛋白进行稳定性、抑酶和抑菌活性研究，发现它们的稳定性没有显著差异，但BmSPI51+tail蛋白和BmSPI51M蛋白抑制真菌的生长的能力显著强于BmSPI51蛋白。以上结果说明，野蚕SPI51活性位点和C端的9个氨基酸是导致野蚕SPI51蛋白抑菌活性更高的主要原因。
3.Seroin1蛋白参与家蚕丝腺核内复制进程
利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，实现了Seroin1基因在家蚕丝腺中的敲除。通过连续的基因组测序，选择缺失两个碱基形式的家蚕个体进行自交，筛选纯合个体。结果发现Seroin1基因被敲除后，整个丝腺变小，丝腺干重、湿重都显著降低，丝腺发育迟缓，特别是从五龄第3天开始丝腺发育明显停滞。我们通过两种方法分析了影响丝腺发育的原因：1、通过分析丝腺细胞的数量，发现与对照组相比没有明显变化；2、通过分析丝腺细胞的体积，发现Seroin1敲除后丝腺细胞的体积明显变小。以上结果表明丝腺变小的关键在于丝腺细胞体积的变小。提取Seroin1敲除品系(Seroin1-/-)的丝腺总DNA，发现与对照组的丝腺细胞DNA含量相比显著降低，到上簇时期仅为对照组的1/4左右。进一步利用5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷(EdU)来标记细胞周期中处于S期(DNA复制)的家蚕丝腺细胞，结果表明Seroin1-/-品系丝腺细胞中的DNA复制明显减弱。我们进一步检测了调控细胞周期关键基因的表达变化，发现Seroin1基因被敲除后，E2F1、cyclinE和CDK2显著上调。在BmE细胞上过表达Seroin1后，E2F1、cyclinE和CDK2显著下调，说明Seroin1确实可以影响E2F1、cyclinE和CDK2的表达量。总之，Seroin1基因被敲除后，细胞周期调控相关基因的表达量显著上调，从而使丝腺细胞的DNA复制进程放缓，导致丝腺细胞体积变小。
4.Seroin1蛋白参与家蚕泌丝行为
通过对敲除Seroin1基因的家蚕泌丝行为的调查，发现Seroin1-/-品系从蚁蚕开始丝纤维分泌量就少于正常家蚕，从三龄到五龄不再分泌丝纤维，导致形成裸蛹表型。观察上簇时期丝腺的形态，发现与正常家蚕相比较，Seroin1-/-品系的中部丝腺颜色变淡、内容物变软，丝腺腔内蛋白在受外力作用时不能形成丝纤维，表明导致Seroin1-/-品系不能吐丝的关键可能在于中部丝腺腔内蛋白的差异。将丝腺分为5个区段后进行切片，观察它们的横截面发现，与正常家蚕相比，Seroin1-/-品系丝腺腔内蛋白没有丝胶层。经qRT-PCR检测和蛋白质组学的分析，我们发现丝胶层蛋白的表达量显著下降，使Seroin1-/-品系丝腺腔内只有丝素蛋白而无丝胶层蛋白。在缺失丝胶层蛋白的情况下，Seroin1-/-品系的丝素蛋白仍然泳动到了前部丝腺，但是却无法分泌到吐丝口之外。利用红外光谱仪分析丝腺腔内蛋白后发现，Seroin1-/-品系丝腺腔内蛋白二级结构发生了很大的变化，无规则卷曲和α-螺旋结构显著增加，而β-折叠和β-转角含量显著下降。通过流变学分析发现，敲除Seroin1基因后的丝腺腔内蛋白与对照相比拥有更低的黏度，初始储能模量与对照相比也更低，且在动态应变扫描过程中的屈服点比对照提前很多。这些结果表明Seroin1-/-品系丝腺腔内的丝蛋白结构更容易受到破坏，即丝胶层对丝素具有重要的保护作用，同时，在缺乏丝胶层蛋白的情况下丝素蛋白将不能正确折叠。