沙门菌病(Salmonellosis)是重要的人兽共患病,是沙门菌(Salmonella)感染引起的人类和动物疾病的总称。该病的主要症状有恶心、呕吐、腹痛、腹泻、发烧和头痛等,另有研究显示,沙门菌感染还会导致尿路感染、败血症、红斑狼疮、类风湿性关节炎、感染性心内膜炎发生。肠炎沙门菌(Salmonella entericaserovar Enteritidis,Salmonella Enteritidis)属于宿主泛嗜性的沙门菌血清型,近年来,该菌已逐渐成为导致人沙门菌病的最主要的血清型之一。肠炎沙门菌不仅会给畜禽养殖业带来重大经济损失,对人类健康所产生的公共卫生安全负担更是无法精确估测,可见肠炎沙门菌感染和污染的防控是一项亟待解决的重要的食品安全问题。然而关于肠炎沙门菌致病机制和防控基础研究的空白点仍然很多,亟待加强和深入。肠炎沙门菌外膜具有保护性功能,有利于菌株的逆境生存与体内入侵。作为菌体外膜结构的重要组分,脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)主要影响沙门菌的光滑粗糙表型、毒力、鞭毛组装以及菌株间的免疫交叉反应。LPS主要由O抗原、核心多糖以及类脂A组成,其中O抗原链的完整性决定着菌株的光滑粗糙表型。因此,LPS合成相关基因的失活可能造成肠炎沙门菌从光滑表型向粗糙表型的转变,但相关基因及其作用机制有待进一步研究。肠炎沙门菌通过Ⅲ型分泌系统(Type Ⅲ secretion system,T3SS)将一系列效应蛋白注入宿主细胞。这些效应蛋白具有多种生物学活性,可以干扰宿主细胞正常功能。其中的效应蛋白AvrA被证实拥有乙酰转移酶活性,且能抑制宿主JNK和NF-κ B信号通路。通过这些方式,AvrA蛋白可以抑制宿主免疫反应,稳定肠道细胞间紧密连接结构,从而利于沙门菌的体内生存和繁殖,但其分子机制仍有待深入揭示。通过分子层面来分析病原菌致病的过程是理解病原菌分子致病机制常用而前景无限的方法,本研究应用信号标签诱变技术(Signature-tagged mutagenesis,STM)构建了肠炎沙门菌转座突变菌株库,使用针对沙门菌O:9抗原的单克隆抗体(O:9单抗)成功筛选到与肠炎沙门菌粗糙型变异相关的基因,并对筛选到的候选基因rfbG、rfbH的生物学功能和可鉴别疫苗(DIVA疫苗)应用可行性进行了初步探究。另一方面,本研究利用肠炎沙门菌avrA基因缺失株、avrA基因回复株以及野生株,感染细胞系、类器官(organoids)、小鼠模型,分析自噬及其相关信号通路的变化规律,揭示了效应蛋白AvrA在调节肠上皮细胞自噬反应过程中的生理学影响与分子机制。以期为深入理解肠炎沙门菌的分子致病机制提供新的认识。1.肠炎沙门菌粗糙型变异相关基因的筛选与鉴定本研究利用STM技术构建了肠炎沙门菌转座突变菌株库,同时建立了利用O:9单抗初筛和吖啶橙复筛的肠炎沙门菌粗糙型变异菌株的玻板凝集筛选方法。初筛结果显示有3株突变株不与O:9单抗发生凝集,进一步复筛发现其中两株突变株与吖啶橙溶液凝集反应强烈,另一株突变株的凝集反应则较弱。后续使用“接头法”定位插入失活基因的结果表明,与吖啶橙溶液凝集反应强烈的两株突变株的插入失活基因分别为rfbG、rfbH,两者均来自rfb基因簇,且位置相邻,分别负责编码一种与O抗原合成相关的脱水酶;而与吖啶橙溶液凝集反应较弱的突变株失活基因为rfc,是独立于rfa和rfb基因簇外的,编码“O抗原聚合酶”的基因。后续选取rfbG、rfbH基因,对其可能对沙门菌基本生物学特性的影响进行了研究:(1)突变株生化特性鉴定试验和体外生长速率测定试验表明,rfbG、rfbH基因的缺失对沙门菌生化特性和体外生长曲线无影响。(2)凝集试验、LPS银染试验和自凝集试验的结果表明rfbG、rfbH缺失株具有典型的粗糙型菌株特性。具体而言,即rfbG或rfbH基因的缺失不仅影响肠炎沙门菌与O:9单抗和吖啶橙的凝集反应;还会使肠炎沙门菌在静置培养过程中形成沉淀;并导致肠炎沙门菌LPS中O抗原链的缺失,以及核心多糖结构的部分缺失与改变。(3)运动性试验结果表明,rfbG、rfbH基因的缺失会大幅削弱肠炎沙门菌的泳动能力和群集游动能力。(4)突变株抗逆性试验显示,野生株与rfbG、rfbH缺失株均对酒精和高温处理高度敏感,但rfbG、rfbH基因的缺失会增加肠炎沙门菌对氧化剂、碱性物质以及消毒剂益欧迪(癸甲溴铵碘复合溶液)的敏感性。本研究揭示了rfbG、rfbH基因之于肠炎沙门菌生存能力的重要性,拓展了对rfbG、rfbH基因,乃至rfb基因簇影响肠炎沙门菌LPS生物合成和鞭毛组装的认知。并为下一步rfbG、rfbH基因做为肠炎沙门菌DIVA疫苗位点的可行性研究提供了生物学材料。2.肠炎沙门菌粗糙型变异株作为DIVA疫苗的初步评价DIVA疫苗和传统疫苗的主要区别是免疫动物产生的抗体能够被区分,即利用配套的鉴别诊断方法(如血清凝集试验或ELISA检测),便可快速甄别免疫动物与天然感染动物。本研究对肠炎沙门菌粗糙型突变株(rfbG、rfbH基因缺失株)进行了可鉴别疫苗(DIVA)特性测试、小鼠安全性评价试验、小鼠免疫保护性试验、雏鸡免疫保护性试验等疫苗学试验探究。血清凝集试验显示,免疫接种rfbG、rfbH基因缺失株的鸡血清与阴性对照组的血清都不与野生型肠炎沙门菌C50041菌苔发生凝集反应,且使用沙门菌ELISA检测试剂盒(flocktype(?)SalmonellaAbELISAkit)也全都检测为沙门菌O抗原抗体阴性;相对的,野生株组或spic基因缺失株组的鸡血清使用两种方式则全部检测为沙门菌O抗原抗体阳性。此外,免疫rfbG缺失株的小鼠血清同样不与野生株菌苔发生凝集反应。综上可见,rfbG、rfbH缺失株不会刺激机体产生针对O抗原的特异性抗体,因而不会被基于沙门菌O抗原抗体检测设计的诊断方法判定为沙门菌阳性。因此,rfbG、rfbH基因位点具有作为肠炎沙门菌DIVA疫苗靶点的潜力。小鼠安全性评价试验和小鼠免疫保护性试验结果显示,rfbG基因单缺失株对小鼠安全、可靠,并能为免疫小鼠提供较为优良的免疫保护效力,结合上一章研究中突变株抗逆性试验结果则表明,rfbG基因单缺失株是对哺乳动物安全、且对环境友好的理想疫苗候选株。SPF鸡保护性试验表明,免疫突变株C50041△spiC-rfbG::Tn5Km2(Cm)可以抑制肠炎沙门菌野生株C50041在SPF鸡肝脏内定殖,可见spiC、rfbG基因双突变株作为肠炎沙门菌DIVA疫苗候选株颇具应用前景。本研究不仅发现了新的DIVA疫苗靶点(基因rfbG、rfbH),还证实研究中建立的基于STM技术利用单抗凝集试验的粗糙型菌株筛选方法,不仅可用于探究病原菌LPS生物合成机制,还可拓展应用于DIVA疫苗靶点的高通量甄选,为疫苗靶点筛选的研究拓宽了思路。3.肠炎沙门菌效应蛋白AvrA通过靶向Beclin-1蛋白抑制宿主自噬反应本研究使用实验室前期工作中构建的肠炎沙门菌avrA基因缺失株、avrA基因回复株以及野生株,感染HCT116细胞系、类器官(organoids)、C57BL/6小鼠,揭示了效应蛋白AvrA对肠上皮细胞自噬反应的影响以及其中的分子机制。经肠炎沙门菌avrA缺失株感染的HCT116细胞,其LC3 Ⅰ蛋白向LC3 Ⅱ蛋白转变的比率显著高于经野生株或回复株感染的HCT116细胞。同时,在avrA缺失株感染的细胞中,p62蛋白的表达量较之野生株与回复株感染组明显降低。此外,经LysoTracker试剂预处理的HCT116细胞,感染avrA缺失株后展现出的溶酶体染色数量,较之野生株或回复株感染组大幅上升。说明在体外培养的细胞模型中肠炎沙门菌效应蛋白AvrA可以抑制细胞的自噬反应。后续WB试验结果显示,经野生株或avrA回复株感染的肠上皮细胞(HCT116细胞系、organoids细胞、小鼠回肠上皮细胞),其Beclin-1蛋白表达水平,较之avrA缺失株感染组显著下降。而经JNK抑制剂处理的HCT116细胞,其Beclin-1蛋白的表达水平在野生株、avrA缺失株、avrA回复株感染组之间无差异。这一发现表明,肠炎沙门菌效应蛋白AvrA是通过抑制JNK信号通路,进而降低Beclin-1蛋白表达。而质粒转染试验表明,C186A位点的突变可以废除AvrA蛋白对JNK信号通路的影响,以及对Beclin-1蛋白表达量的调控作用。免疫共沉淀试验的结果证实,AvrA蛋白可与Beclin-1蛋白发生互作。此外,质粒共转染试验还观察到,AvrA蛋白可以下调Beclin-1蛋白泛素化的水平,C186A点突变的AvrA蛋白则失去了去泛素化酶活性。经肠炎沙门菌感染的小鼠的回肠样品的溶菌酶素染色结果显示,野生株感染的小鼠,其正常Paneth细胞数量,较之avrA缺失株感染组大幅下降。即野生株感染组的Paneth细胞中的分泌颗粒更多呈现损耗(disorganized)、殆尽(diminished)或罄尽(diffuse)的状态。综上所述,肠炎沙门菌效应蛋白AvrA在与宿主肠上皮细胞相互作用过程中,通过抑制JNK信号通路,降低宿主Beclin-1蛋白的表达。由此,肠炎沙门菌实现抑制宿主自噬反应,进而利于该菌的体内生存。此外,AvrA蛋白对小鼠Paneth细胞分泌颗粒状态的影响,也可能是通过抑制宿主自噬反应实现的。本研究发现了一条肠炎沙门菌及其效应蛋白颠覆宿主细胞生物学过程的全新策略,扩展了我们对肠炎沙门菌致病机制的认知。