背景和目的脊椎动物的发育过程中,神经嵴细胞来源的多能干细胞的命运是由上下相关的外在和内在的信号来驱动并控制其分化整合。协同又拮抗的分子信号可以调节神经嵴衍生物的发展并在适当的时间和部位产生适当数量的细胞网络。神经嵴来源的牙源性间充质细胞包含?多能干细胞,可以分化为成牙本质细胞,软骨细胞和成骨细胞。然而,在信号网络中调节牙源性间充质细胞命运的关键线索仍是未知。在牙本质发育过程中,来源于颅神经嵴（cranial neural crest,CNC）细胞分化的成牙本质细胞,在牙本质的分泌形成过程中起着至关重要的作用。成牙本质细胞的分化由内釉上皮控制,同时也取决于机体介导的相互作用。Hippo信号转导通路是控制干细胞增殖并决定器官大小的关键因素,而Yes-associatedprotein（YAP）是Hippo信号通路中一个关键的转录共激活因子。YAP基因也被证明是与人类多种癌症的发生发展相关的一个候选基因。YAP的活性是由Hippo信号通路中的上游激酶（Mst1/2,sav1,LatS1/2和Mob1等）的逆向调节完成。YAP信号蛋白和其同源的TAZ信号分子被通路上游蛋白激酶磷酸化后,导致降解而失去活性。Hippo信号通路中的信号分子受到抑制,可释放YAP/TAZ,然后其进入细胞核。在细胞核中,YAP/TAZ与TEAD或Smad等其它转录因子结合激活其靶基因的转录。传统的基因敲除YAP小鼠早期胚胎致死的原因是由于存在卵黄囊血管缺陷。过表达YAP基因的结果,在果蝇中可增大器官大小,在小鼠中表现为细胞增殖和细胞凋亡的抑制。此外,YAP基因也在维持小鼠胚胎干细胞多能性和调节组织特异性干细胞中起着关键的作用。虽然在从果蝇到哺乳动物跨度的生物系统之间,Hippo通路中起重要作用的核心分子蛋白的组成都是高度保守的,在发育的不同时期和不同部位激活YAP基因可导致有很大的差异。例如,YAP在小鼠小肠中的表达导致细胞类型终末分化的异常,但没有明显的提高整个器官的大小。在果蝇中,YAP基因的同源基因Yki过表达可导致cycE,diap1,和bantam等microRNA的表达。在哺乳动物细胞中,YAP可诱导Birc2、Birc5、两个Diap1同源基因,和结缔组织生长因子（connective tissue growth factor,CTGF）等分子信号的表达。大多数情况下YAP的作用似乎与组织和细胞特异性相关,这表明在哺乳动物中YAP的功能是通过各种关联的蛋白质分子前后依赖的方式调节。YAP作为一个转录激活因子调控干细胞分子的持续更新和向不同功能细胞分化的过程。以往的研究已经证明:牙齿胚胎的发育过程是来源于内胚层的颅神经嵴的牙源性间充质和来源于外胚层的牙源性上皮与之间相互诱导分化的过程。牙胚发育的早期阶段与其他来源于外胚层的器官发生发展类似。在牙胚发育过程中,形成牙囊的上皮细胞与形成牙本质和牙髓的间充质细胞之间的信号互相传递,互相影响,既有胚胎发育的固定遗传程序,也同时会受到多种局部因素的调节,形成一个局部相互链接的信息反馈回路。这些信号分子在细胞和组织之间传播,可在上皮细胞组织和间充质细胞之间传递发育信号,并且调控牙胚发育向着恒定且有序的分化增生的方向进行。同时上皮-间充质相互作用导致的细胞分化和发育又可反向调节各种信号分子的表达。与其他器官的发生发展相比,发育中的小鼠牙胚是一个用来研究干细胞发育生物学的理想模型。牙齿发育的过程不但是研究进化的一个良好模型,也是研究牙源性上皮细胞与牙源性间充质干细胞之间相互分化诱导作用关系的工具之一。因此,本研究拟通过Cre-LoxP酪氨酸重组酶和四环素反式激活因子（reverse tetracycline-controlled transactivator,rtTA）,构建YAP的过表达动物模型,利用Wnt1在胚胎发育的特定时期表达与神经嵴来源的间充质细胞的特点,在牙胚发育的特定阶段过表达YAP基因,达到构成式激活YAP的目的,观察特定时空中过表达YAP对颅颌面骨发育和牙胚发育的影响。材料和方法获取不同胚胎发育时期（E15.5,E16.5,E18.5天等）对照小鼠和Wnt1-Cre;YAP Tg;R26R转基因小鼠胚胎,利用micro-CT、骨骼染色等技术观察对照小鼠与转基因小鼠颅颌面骨骼差异,HE染色观察牙胚变化;用原位杂交技术检测YAP基因及FGF信号家族,TGF信号家族,Wnt信号家族,Shh家族中信号分子在小鼠牙齿发育过程中特异性表达,检测YAP信号分子在牙胚牙板上皮细胞、牙囊的间充质干细胞及牙齿胚胎发育中的作用,以及对多种在牙胚发育中起重要作用的基因表达的影响。1.转基因小鼠构建Wnt1-cre转基因系小鼠、YAP Tg和R26R条件敲除等位基因小鼠,将Wnt1-Cre+雄性小鼠与YAP Tg+R26+雌性小鼠交配,获取Wnt1-Cre;YAP Tg;R26R转基因小鼠。利用PCR对尾端DNA进行基因分型鉴定。通过PCR基因分型鉴定突变胚胎是否存在Wnt1-Cre;、YAP Tg、R26R。雌鼠发现阴道栓的当天中午为孕期E0.5天。本研究中使用的所有小鼠胚胎来自于C57BL6/J谱系。组织学和骨骼染色分析组织学分析,从怀孕雌性动物身上收集胚胎,在4℃下固定在4%多聚甲醛（paraformaldehyde,PFA）中过夜,通过25%-50%-75%-100%乙醇由低到高梯度脱水,用石蜡包埋于组织块中,并在环境温度8℃下以8μm厚度切取组织连续切片厚。常规切片采用苏木精和伊红染色。解剖不同时期小鼠胚胎并完全除去其皮肤和内脏器官、脂肪和尽量多的肌肉,保存骨骼标本。以95%乙醇/阿尔辛蓝染色和茜素红溶液染色骨骼标本,置于100%甘油中保存。2.免疫荧光染色和原位杂交对于免疫荧光染色和原位杂交,胚胎在4℃下在4%PFA中固定过夜,并进行石蜡切片处理。切片经间接免疫荧光染色和原位杂交染色。使用地高辛标记RNA探针。细胞增殖与凋亡分析Edu实验检测细胞增殖。怀孕小鼠每100克体重注射1ml10mM Edu溶液,2小时后处死雌鼠收集胚胎,分离胚胎下颌骨。样品在4%多聚甲醛（PFA）中固定24H以上,石蜡包埋,制备相应厚度的组织切片（8μm）。使用Edu染色试剂盒检测牙胚组织细胞增殖情况。使用TUNEL检测试剂盒（荧光素）（罗氏公司）通过末端脱氧核苷酸转移酶介导的d-UTP生物素缺口末端标记（TUNEL）来检测细胞内的DNA片段,以检测分析牙胚组织内的细胞凋亡情况。石蜡切片进行再水化和蛋白酶K处理。底物反应后,用Vectashield?固定培养基（Vector）固定载玻片,并在荧光显微镜下观察。3.牙齿发育相关因子转录组学比较获取小鼠胚胎头颅后,以4℃PBS溶液清洗小鼠头颅胚胎,在显微镜下摘取小鼠颌骨,分离小鼠磨牙胚胎。然后提取和纯化总RNA,评价获得的RNA样本质量。为了减少个体与胚胎的差异,每个RNA-seq样本从三个不同的生物学胚胎提取的牙胚中提取,保证最后提取总RNA量相同。提取基因测序序列,比较Wnt1-Cre;YAP Tg转基因小鼠和对照组牙胚转录组谱。结果1)小鼠胚胎发育的第14.5、15.5、16.5、18.5天以及新生小鼠,Wnt1-Cre;YAP Tg转基因小鼠胚胎相比于对照组小鼠,都可以观察到:眼睑张开未融合,舌体已经伸出口外,颌骨发育明显变短,鼻尖处有黑色素沉淀;皮下毛细血管发育增多,颅顶弧线高耸圆滑。Micro-CT和骨骼染色检查可见:Wnt1-Cre;YAP Tg转基因小鼠,颅骨发育短粗,骨骼钙化不佳,顶骨较对照小鼠厚度明显偏薄,枕部、鼻尖软骨发育体积比对照小鼠偏小。下颌支粗短、肥大,钙化差,毛玻璃感强烈。下颌麦柯尔软骨,下颌角、髁突末端的软骨几不可见。YAP主要集中表达在牙源性上皮的基底细胞,而在Wnt1-Cre;YAP Tg转基因小鼠,YAP在牙乳头及牙囊等间充质来源组织广泛表达。原位杂交也有相同的表达模式。HE染色显示,Wnt1-Cre;YAP Tg转基因小鼠磨牙牙胚形态发育相比对照组小鼠明显体积减小。在Wnt1-Cre;YAP Tg转基因小鼠牙胚的内釉上皮层,外釉上皮层细胞连续性断裂,在星网状层显示有较粗壮的字样血管的形成。Wnt1-Cre;YAP Tg转基因小鼠下颌中切牙牙胚可见颈环（cervical loop）体积相比对照组小鼠胚胎明显减小,Wnt1-Cre;YAP Tg转基因小鼠牙胚的牙乳头及牙囊发育与对照组小鼠相比无太大差别。2)对于小鼠胚胎磨牙牙胚的原位杂交检测显示:Sprouty2在对照牙源性上皮中微弱表达,在转基因小鼠的牙源性上皮和间充质细胞中表达增强。FGF3在对照小鼠中牙尖部位表达,而在转基因小鼠中,表达显著降低。FGF9正常表达于牙源性上皮基底细胞,在转基因小鼠相同部位只有轻微表达。FGF10在牙尖部位和牙乳头表达,在转基因小鼠中表达抑制,只在牙乳头局部轻度表达。Sprouty基因编码FGF的抑制因子,FGF3,FGF9,FGF10等信号分子的表达在转基因小鼠中显著受到抑制。TGFb1在对照小鼠集中表达在颈环和内釉上皮中。在Wnt1-Cre;YAP Tg转基因小鼠中,上皮中表达的TGFb1被显著抑制。BMP4的表达在对照小鼠位于牙乳头的牙尖区域,在YAP Tg转基因小鼠中,表达范围扩大到牙乳头区,信号轻度增强。Shh基因在对照小鼠主要表达于钟状期的内釉上皮细胞中,在小鼠牙胚中表达强度、模式无明显异常。多数小鼠内釉上皮折叠减少,并伴有第二釉结形状异常。YAP信号在Wnt1-Cre;YAP Tg转基因小鼠软骨和骨组织中表达增强,b-catenin在麦柯尔软骨中表达抑制明显。Edu染色显示,无论在牙源性上皮和牙乳头间充质细胞中,Wnt1-Cre;YAP Tg转基因小鼠增殖细胞比率的减少,相对于对照小鼠并没有统计学意义变化。TUNEL检测细胞凋亡,无论对照小鼠或者Wnt1-Cre;YAP Tg转基因小鼠都没有在成釉器检测到凋亡细胞。3)RNA-Seq数据显示,随着YAP基因的表达,FGF基因家族表达发生了明显的变化。FGF3、FGF9和FGF10转录水平的变化与YAP过表达的变化同时发生。Sprouty基因家族表达也发生了明显的变化。Sprouty的转录水平上调和YAP基因的过表达同时发生。qPCR数据和原位杂交检测也证明了Sprouty2基因的上调表达。结论1.YAP作为Hippo信号通路的重要组成部分,在正常小鼠牙齿的发育中是持续表达的,利用Wnt1-cre,R26R基因可以构建YAP基因在胚胎发育的特定时期在颅面部和牙胚中持续过表达。2.在胚胎发育过程中,构成式激活YAP,会严重影响颅颌面部发育,新生小鼠表现为颅骨发育短小和面裂。胚胎期小鼠表现为颅颌面骨钙化异常,软骨发育异常,颅骨畸形。3.在胚胎发育过程中,构成式激活YAP,导致小鼠磨牙牙胚发育异常,牙胚体积减小,但牙源性上皮和间充质干细胞的组织分化未收受到明显影响,多个与牙齿发育相关的信号因子出现抑制或增强的现象,YAP能通过增强Sprouty信号家族的表达,进而抑制了 FGF信号家族表达,从而影响到了牙胚发育。