随着化石资源的日益消耗和随之而来的环境问题,绿色、可持续的生产模式受到越来越多的关注。利用微生物细胞工厂,转化可再生生物质资源生产燃料和化学品,为解决化石资源枯竭和环境污染等问题提供了有效的解决方案。因此,生物炼制和生物制造等概念也随之兴起。但是目前生物炼制和生物制造使用的主要原料为糖类,如葡萄糖等,这不仅造成了与人争粮的局面,而且糖质原料价格的上升,也使得生物基燃料和化学品的生产成本较高,市场竞争优势不明显。寻找糖质原料的非粮替代原料,是实现绿色生物制造的重要环节。近年来,随着生物柴油产业的快速发展,甘油作为主要副产物,产量大幅增加,价格也逐渐下降,成为了生物制造理想的原料。此外,甘油的平均碳原子还原程度比常见糖质原料均高,说明其在生物代谢过程中可以释放更多的还原力,供给产物的合成。因此,使用天然筛选或人工改造的微生物作为细胞工厂,转化甘油生产燃料和化学品成为研究热点,也有一些商业化的成功案例。1,3-丙二醇（1,3-propanediol,1,3-PD）是用途广泛的大宗化学品,可用作溶剂、润滑剂、抗冻剂、粘合剂和保护剂等,在高分子材料、食品、医药、化工和化妆品等领域有着广泛的应用。1,3-PD最重要的应用是作为合成聚对苯二甲酸丙二醇酯（polytrimethylene terephthalate,PTT）的单体,后者是一种具有优良性能的新型聚酯材料。乳酸被美国能源部评选为最有前景的平台化合物之一,也是合成聚乳酸（poly-lactic acid,PLA）的单体。由于具有生物可降解性和环境友好性等特点,PLA被认为是石化来源的塑料的环境友好替代物。1,3-PD和乳酸的化学生产方法存在一些局限,因此其生物生产方法受到更多关注。1,3-PD和乳酸的生物合成途径、生产菌株和发酵工艺都是研究的热点。但是,现有的生物合成方法和工艺还存在一些问题,例如产物浓度低、底物利用效率低等问题。开展微生物转化甘油合成1,3-PD和乳酸的应用基础研究,将有利于加深研究者对甘油代谢、1,3-PD和乳酸合成限制因素的理解,从而利用代谢工程等手段,构建更高效的细胞工厂,实现1,3-PD和乳酸的高效生物生产。针对目前生物法生产1,3-PD和乳酸面临的问题,本论文从生产菌株基因组测序分析、代谢工程构建联产菌株、共底物发酵等几个方面开展了应用基础研究,具体研究内容如下:本论文的第二章对课题组前期筛选得到的两株1,3-PD生产菌,产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）PDL-0 和巴氏梭菌（Clostridium baratii）XCM,以及丁酸梭菌（C.butyricum）模式菌株DSM 10702进行了基因组测序,分别得到了6.55 Mb、3.08Mb和4.59 Mb的基因组草图。其中,C.butyricum DSM 10702 的基因组序列已提交至公共数据库,GenBank索取号为AQQF00000000。利用RAST服务器对三株菌的基因组进行了注释,解析了三株菌中与甘油代谢和1,3-PD合成相关的dha操纵子。结合NCBI数据库中已有的1,3-PD生产菌株的基因组信息,对 Klefbsiella 属、Citrbacter属和Clostridium属的 1,3-PD 生产菌株的dha操纵子进行了对比,发现这些菌株的dha操纵子可大致分为三类。第一类为同属于肠杆菌科的Klebsiella属和Citrobacter属的1,3-PD生产菌;第二类为Clostridium 属一些 1,3-PD 生产菌,例如C.baratii XCM 和 C.pasteurianum DSM 525;第三类为Clostridium属另一些1,3-PD生产菌,例如C.diolis DSM 15410和C.butyricum DSM 10702。结合dha基因簇中关键酶氨基酸序列的进化树分析,发现第二类与第三类虽同属于Clostridium属,但是第二类的dha基因簇与第一类的同源性较高,基因排列也比较类似,说明它们的dha操纵子具有更近的进化关系,这可能与微生物获得dha操纵子和1,3-PD合成能力的来源相关。针对目前生物转化甘油合成1,3-PD转化率低和副产物多的问题,本论文的第三章制定了在维持细胞还原力平衡的前提下,联产1,3-PD及光学纯D-学乳酸的策略。首先,为选择合适的联产目标产物,设定了 5个标准:1、联产产物应具有较高的商业价值和应用价值;2、联产产物的合成途径应该尽量避免碳损失;3、联产产物的合成途径可以与1,3-PD的合成途径维持NADH的平衡;4、联产产物应该具备很好的生物相容性,从而有利于获得高的产物浓度;5、联产产物应与1,3-PD较易分离。参照上述标准,对K.oxytoca PDL-0甘油氧化途径的主要代谢物D-乳酸,2,3-丁二醇（2,3-butanediol,2,3-BD）、乙醇、乙酸、琥珀酸和甲酸进行了评估,最终选定D-乳酸作为1,3-PD的联产产物。之后对K.oxytoca PDL-0进行了系统的代谢工程改造,敲除了 2,3-BD、乙醇、乙酸、琥珀酸及甲酸合成途径的关键基因,构建了可联产1,3-PD和D-乳酸的基因工程菌株,选择其中最过发酵条件优化,实现了发酵甘油高效生产1,3-PD和光学纯D-乳酸,最终1,3-PD的产量可达到76.2 g/L,生产强度达到2.5 g/L·h,D-乳酸产量可达到111.9 g/L,生产强度达到3.7 g/L·h,两种产物的总转化率达到95.4%。在第三章工作的基础上,为实现联产1,3-PD与光学纯L-乳酸,第四章对菌株PDL-5继续进行代谢工程改造。首先,将菌株PDL-5的D-乳酸脱氢酶基因替换为干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）ATCC 334的L-乳酸脱氢酶基因,获得的基因工程菌仅生产少量L-乳酸,但是积累了大量的中间产物丙酮酸,说明胞内L-乳酸脱氢酶水平较低。为提高酶活,使用质粒和诱导型启动子测试了来自L.casei ATCC 334、凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）2-6,以及K.oxytoca PDL-0的L-乳酸脱氢酶,选择了最优的来自B.coagulans 2-6的L-乳酸脱氢酶。最后将该L-乳酸脱氢酶编码基因插入到基因组中2,3-BD合成基因簇的组成型启动子之后,构建了菌株PLL。通过分批补料发酵,可生产70.0 g/L的1,3-PD和104.0 g/L的光学纯L-乳酸,两种产物的转化率分别为42.5%和53.4%,总转化率达到95.9%。使用Clostridium属的1,3-PD生产菌,在厌氧条件下发酵甘油是1,3-PD生产的另一种常用方法。但是1,3-PD生产过程中也会积累乙酸、丁酸和丁醇等副产物。由于常用的1,3-PD生产菌株如C.diolis DSM 15410和C.butyricum DSM 10702难以进行遗传操作,因此对它们的代谢工程改造十分困难。低底物转化率和高浓度副产物已经成为厌氧发酵生产1,3-PD的主要限制因素。为提高梭菌厌氧发酵甘油生产1,3-PD的转化率,第五章研究了 C.diolis DSM 15410共代谢甘油和廉价碳源木质纤维素水解液生产1,3-PD的能力。木质纤维素水解液中主要糖成分为葡萄糖、木糖和阿拉伯糖。因此,首先分别利用三种糖作为甘油发酵的共底物,结果表明糖类的加入可有效提高1,3-PD对甘油的转化率（18%-28%）。之后,采用三种糖的混合糖与甘油作为共底物进行发酵,1,3-PD的转化率提高了 22%.此外,发现C.diplis DSM 15410共代谢甘油和混合糖时,细胞内还原力水平明显上升,而甘油氧化途径关键基因dhaD的转录明显下降,这有利于高转化率的合成1,3-PD。最后选取了两种不同的木质纤维素水解液,玉米秸秆水解液与木糖母液,分别与甘油进行共发酵,可以获得较高的1,3-PD转化率（0.85 mol/mol）。在分批补料发酵实验中,添加木质纤维素水解液,可以使甘油到1,3-PD的转化率从0.62 mol/mol提高到0.82 mol/mol。使用粗甘油与木质纤维素水解液作为共底物也可达到相似的水平。这些结果表明,共发酵廉价的木质纤维素水解液和甘油可提高1,3-PD生产的经济性。最后一章对铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）XMG的FadR型乳酸代谢调控因子LldR（PLldR）蛋白开展了序列分析和蛋白结晶的研究。首先对不同来源的LldR蛋白进行了序列相似性网络分析,包括大肠杆菌（Escherichia coli）、和P.aeruginosa的LldR蛋白等。结果表明来自E.coli的LldR与P.aeruginosa XMG的LldR在两个不同的簇中,暗示了 LldR家族可能在功能上来自于两种祖先。之后,分析了E.coli、C.glutomicum 和P.aeruginosa XMG 三个来源的 LldR蛋白的氨基酸同源性,通过氨基酸序列比对定位了P.aeruginosa XMG的LldR蛋白与DNA及Zn2+结合的关键氨基酸位点。之后将预测的二级结构和三级结构比对,证明三个不同来源的LldR蛋白的N端序列保守性较高,结构类似,而C端的配体结合域差异较大。之后,构建了 P.aeruginosa XMG的LldR蛋白的表达宿主E.coli BL21（pET-28A-PLldR）,实现了重组蛋白PLldR的可溶性表达。利用纯化的蛋白,经过结晶条件筛选,确定了最佳的蛋白结晶条件,获得了蛋白晶体,并得到了分辨率为2.5A的衍射数据。数据表明PLldR蛋白晶体属于P3空间群,且晶胞参数为a = 68.5 A,b = 68.5 A,c = 237.0 A。以上结果为进一步理解假单胞菌来源的LldR蛋白的调控机制和配体结合方式提供了基础。