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塞尼卡病毒病是由塞尼卡病毒（Senecavirus A，SVA)引起的一种猪的原发性水泡病、可引起仔猪腹泻，经产母猪和公猪鼻、上颚、口腔、唇部和蹄冠周围出现小泡和溃疡，偶发腹泻症状，1-3天的新生仔猪死亡率可达30%-70%，给养猪行业造成巨大的经济损失。
1. 塞尼卡病毒的分离鉴定 为了分离塞尼卡病毒并进行进一步的诊断和防控技术的研究；本研究采集发病猪鼻部、蹄部水泡液及皮痂，通过PCR方法筛选阳性病料，接种传代细胞系进行培养及空斑纯化，对纯化的病毒进行透射电子显微镜、间接免疫荧光鉴定，测定病毒TCID50并进行病毒全基因序列测序分析。结果表明得到一株毒价高、纯度高的 SVA毒株以及其全基因序列；其能在BHK21细胞上稳定传代培养；电镜鉴定可观察到呈正20面体对称、直径约为27nm 无囊膜的 SVA 粒子；间接免疫试验表明病毒粒子分布在细胞核中， TCID50测定结果为1×10-12.5/0.1 mL；对其进行同源性分析表明该毒株与美国株的同源性相对较高。该病毒的分离鉴定为下一步SVA VP1蛋白的表达、间接ELISA方法的建立及单抗的制备奠定基础。
2. 基于SVA结构蛋白 VP1间接ELISA检测方法的建立及初步应用 为建立检测新传入我国SVA的ELISA检测方法，本研究以GenBank中收录的SVA序列VP1为模板设计引物，扩增其VP1基因，将目的片段克隆入pET-32a(+)表达载体中进行原核表达、纯化，以纯化的的重组VP1（rVP1）蛋白作为包被抗原，通过矩阵法优化ELISA反应条件。并进行敏感性、特异性和重复性进行检验，对43份背景清晰猪血清进行检测并与中和试验结果进行比较，对205份临床猪血清样品进行应用检测。结果表明，本研究成功扩增了长度867 bp VP1基因，表达了大小51.0 kDa左右的可溶性重组蛋白， Western-blot试验表明纯化的rVP1蛋白具有良好的反应原性。矩阵法筛选的间接ELISA最佳包被浓度为2 μg/mL，血清稀释度为1∶200，作用时间1 h酶标二抗的最佳稀释度为1∶5 000，作用时间0.5 h。本方法可特异性检测SVA抗体，而与FMDV （ O/A/AsiaI ）、PEDV、PCV2、PRRSV、PRV等病原的阳性血清均无交叉反应；批内、批间的重复性检验变异系数均小于10%，具有较好的重复性和稳定性。43份猪血清样品的检测结果与中和试验符合率为93.02%。205份临床血清的阳性检出率为5.37%。本研究为SVA血清学检测提供了技术手段，也为下一步单抗的筛选提供基础。
3. 抗SVA VP1蛋白单克隆抗体制备及初步应用 为了制备针对SVA VP1蛋白的单克隆抗体；按照常规技术免疫小鼠，将小鼠血清倍比稀释用所建立的间接ELISA方法检测小鼠抗体效价，将检测效价大于1∶80 000的小鼠脾脏充分研磨后过铜网后在PEG的作用下与事先培养好的SP/20细胞进行融合，融合后将其分到96孔板中，逐日观察96孔板，将融合成功的孔取上清用建立的ELISA方法进行检测，对阳性孔进行5轮亚克隆后，后获得3株分泌抗SVA的单克隆抗体杂交瘤细胞株，分别命名为1B2、3H9和9C3。对单抗效价及亚型进行鉴定，筛选出效价高且为IgG亚型的单抗，将杂交瘤细胞扩大培养并注射入小鼠腹腔，收集腹水后对其进行纯化，对单抗进行稳定性、SDS-PAGE、特异性、Western-blot检测、以及免疫组化应用；结果表明成功得到了一株能稳定分泌单抗的杂交瘤细胞株；其稳定分泌的单抗亚型为IgG1、稳定性好、纯度高、特异性强、效价能达到1∶1×106；进一步应用到Western blot试验及免疫组化试验表明该单抗具有较强的特异性，为下一步建立基于单抗的检测方法奠定了基础。
1. 塞尼卡病毒的分离鉴定 为了分离塞尼卡病毒并进行进一步的诊断和防控技术的研究；本研究采集发病猪鼻部、蹄部水泡液及皮痂，通过PCR方法筛选阳性病料，接种传代细胞系进行培养及空斑纯化，对纯化的病毒进行透射电子显微镜、间接免疫荧光鉴定，测定病毒TCID50并进行病毒全基因序列测序分析。结果表明得到一株毒价高、纯度高的 SVA毒株以及其全基因序列；其能在BHK21细胞上稳定传代培养；电镜鉴定可观察到呈正20面体对称、直径约为27nm 无囊膜的 SVA 粒子；间接免疫试验表明病毒粒子分布在细胞核中， TCID50测定结果为1×10-12.5/0.1 mL；对其进行同源性分析表明该毒株与美国株的同源性相对较高。该病毒的分离鉴定为下一步SVA VP1蛋白的表达、间接ELISA方法的建立及单抗的制备奠定基础。
2. 基于SVA结构蛋白 VP1间接ELISA检测方法的建立及初步应用 为建立检测新传入我国SVA的ELISA检测方法，本研究以GenBank中收录的SVA序列VP1为模板设计引物，扩增其VP1基因，将目的片段克隆入pET-32a(+)表达载体中进行原核表达、纯化，以纯化的的重组VP1（rVP1）蛋白作为包被抗原，通过矩阵法优化ELISA反应条件。并进行敏感性、特异性和重复性进行检验，对43份背景清晰猪血清进行检测并与中和试验结果进行比较，对205份临床猪血清样品进行应用检测。结果表明，本研究成功扩增了长度867 bp VP1基因，表达了大小51.0 kDa左右的可溶性重组蛋白， Western-blot试验表明纯化的rVP1蛋白具有良好的反应原性。矩阵法筛选的间接ELISA最佳包被浓度为2 μg/mL，血清稀释度为1∶200，作用时间1 h酶标二抗的最佳稀释度为1∶5 000，作用时间0.5 h。本方法可特异性检测SVA抗体，而与FMDV （ O/A/AsiaI ）、PEDV、PCV2、PRRSV、PRV等病原的阳性血清均无交叉反应；批内、批间的重复性检验变异系数均小于10%，具有较好的重复性和稳定性。43份猪血清样品的检测结果与中和试验符合率为93.02%。205份临床血清的阳性检出率为5.37%。本研究为SVA血清学检测提供了技术手段，也为下一步单抗的筛选提供基础。
3. 抗SVA VP1蛋白单克隆抗体制备及初步应用 为了制备针对SVA VP1蛋白的单克隆抗体；按照常规技术免疫小鼠，将小鼠血清倍比稀释用所建立的间接ELISA方法检测小鼠抗体效价，将检测效价大于1∶80 000的小鼠脾脏充分研磨后过铜网后在PEG的作用下与事先培养好的SP/20细胞进行融合，融合后将其分到96孔板中，逐日观察96孔板，将融合成功的孔取上清用建立的ELISA方法进行检测，对阳性孔进行5轮亚克隆后，后获得3株分泌抗SVA的单克隆抗体杂交瘤细胞株，分别命名为1B2、3H9和9C3。对单抗效价及亚型进行鉴定，筛选出效价高且为IgG亚型的单抗，将杂交瘤细胞扩大培养并注射入小鼠腹腔，收集腹水后对其进行纯化，对单抗进行稳定性、SDS-PAGE、特异性、Western-blot检测、以及免疫组化应用；结果表明成功得到了一株能稳定分泌单抗的杂交瘤细胞株；其稳定分泌的单抗亚型为IgG1、稳定性好、纯度高、特异性强、效价能达到1∶1×106；进一步应用到Western blot试验及免疫组化试验表明该单抗具有较强的特异性，为下一步建立基于单抗的检测方法奠定了基础。