大量研究指出,铁蛋白主要生理功能是释放铁给细胞,合成含铁的酶蛋白,储存细胞中的过量铁,避免产生铁中毒现象。哺乳动物铁蛋白由H和L亚基组成,其中H亚基负责络合亚铁离子和氧化亚铁形成高铁组分,L亚基负责铁核形成与矿化。有关铁蛋白亚基类型、亚基之间的相互作用强度和执行新生理功能还存在着争议。本文以猪胰脏铁蛋白(pig pancreas ferritin,PPF)为实验材料,优化铁蛋白分离技术,小批量制备高纯度的PPF。选用SDS-PAGE方法分析了PPF由H(21.0kDa),L亚基(19.0 kDa)和SH(small H subunits)小亚基组成。选用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF/TOF MS)直接分析PPF中含有不稳定的H和SH亚基,其中L-L、H-L、L-SH和H-SH亚基之间的相互作用强度较高。采用反相高压液相色仪(RP-HPLC)技术也发现,PPF由H、L和少量SH亚基组成,推算L/H亚基之间的比值约为2:1。采用MALDI-TOF MS技术分析PPF中不稳定的H和SH亚基,其分子量分别为20135.015 Da和12925.221 Da。采取混合基质,增强质谱仪的激光强度和提高反应介质酸度等措施,MALDI-TOFMS技术获得PPF对应4个亚基质谱峰,其m/z值分别为9981.82,10649.16,19960.71和20835.96 Da,对应的亚基分子式为[M2+]L、[M2+]H、[M+]L和[M+]H,但未获得SH亚基的质谱信息,说明PPF亚基之间的相互作用强度,稳定性随亚基结构的变化而变化。分别采用ESI-Q-TOF MS技术和RP-HPLC-ESI-Q-TOF MS分别鉴定PPF亚基类性、相互作用强度和计算它们同源性信息。酶解实验结果表明,与野猪相比,其H和L亚基同源性分别达到85％和100％(部分序列),并同样发现PPF中的部分H亚基不稳定,易被解离成准亚基离子,供质谱分析。　　 钾离子通道阻滞剂四乙胺(TEA)和四氨基吡啶(4-AP)均能高效阻断细胞膜上的钾离子通道。TEA直接络合于铁蛋白H亚基上,形成PPFH-TEA复合物,未发现络合于L亚基的PPFL-TEA复合物。选用化学强还原剂Na2S2O4和生物还原剂Vc,分别研究PPF释放铁的动力学全过程,指出PPF释放铁的全过程可分为快速释放铁(一级反应动力学)和慢速释放铁(零级反应动力学)的过程。其变化趋势和规律与PPFH-TEA复合物释放铁全过程很相似。　　 TEA和4-AP也能阻断癌症细胞细膜上的钾离子通道,从而起到抑制细胞生长效果。紫杉醇、TEA和4-AP抑制肿瘤细胞生长已有详细的研究报道,但用于分别或协同抑制肿瘤细胞生长或揭示其凋亡分子机制的研究报道甚少。本论文选用MTT、单染/双染流式细胞术分别研究诱导人宫颈癌(Hela)细胞凋亡速率和变化趋势,证实了这三种抑制剂能协同增强抑制Hela细胞凋亡速率,且死亡的主要原因为细胞凋亡和细胞坏死。运用细胞膜片钳技术在全细胞模式下测定Hela细胞膜上的钾电流,在TEA处理组中,电流抑制率高达80％。MALDI-TOF MS技术证实TEA能改变Hela细胞膜表层的多肽分布与组成,可能是TEA能诱导细胞表达差异蛋白质或多肽。选用顺铂-人血清转铁蛋白诱导HepG2肝癌细胞凋亡过程中所表达的26种差异蛋白质为目标蛋白,设计对应的引物,研究在TEA和4-AP分别诱导Hela细胞凋亡过程中所产生mRNA表达情况与趋势,并发现这26种蛋白质均得到差异表达,可见TEA和4-AP类似其他抗肿瘤药物,均通过相同或相似的途径和机制诱导肿瘤细胞凋亡。　　 选用蛋白质组学及相关分析技术筛选与鉴定出TEA诱导Hela细胞凋亡过程中的差异蛋白质,发现33个蛋白表达量上存在显著的差异,其中13个蛋白表达量上调,20个蛋白表达量下调。差异蛋白质涉及ATP结合,分子伴侣,酶的活性,钾钙离子结合,细胞转运,氧化还原平衡,代谢等多种分子生物功能,通过差异蛋白的亚细胞定位发现,TEA主要的靶向位点为细胞质蛋白。选用IngenuityIPA软件分析得到差异蛋白涵盖细胞移动,肿瘤形成,细胞发育等蛋白网络。此外采用western-blotting分析谷胱甘肽S转移酶(GSTO1)差异蛋白的表达水平,其表达量随TEA浓度递增而降低。Real-time PCR分析Hela表达的33种差异蛋白所对应的mRNA水平、变化趋势和规律基本上与2D-PAGE分离胶中蛋白质表达量相似。这些结果进一步佐证了采用蛋白质组学技术筛选的由TEA诱导Hela细胞表达的差异蛋白的可靠性,揭示TEA不仅阻断Hela钾离子通道,而且在蛋白合成的过程中,通过影响细胞的转录调控机制,诱导肿瘤细胞凋亡。TEA属于带强毒性的抗肿瘤药物,诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制类似于临床一线用药。本论文立题新颖,研究内容具有重要的科学意义,并潜在着应用价值。