论文部分内容阅读
烟草(Nicotianatabacum)作为我国重要的经济作物,是国家税收的重要来源,烟草也是生物学研究的模式植物。青枯病(bacteriawilt)是世界范围内植物病害防治的一大难题,目前还未有有效的防治手段。通过分子育种技术培育抗青枯病品种可从根本上解决烟草青枯病的问题。大多数植物抗病基因为NBS-LRR类抗病基因,其在植物抗病防御反应中起重要的作用。因此,通过克隆烟草NBS-LRR类抗青枯病相关候选基因,深入挖掘鉴定该类基因的抗青枯病功能,有助于推进烟草抗青枯病分子机理的研究,为烟草抗青枯病品种培育提供优异的基因资源。本研究基于实验室前期的烟草基因芯片数据,筛选两个在抗、感青枯病烟草品种中差异表达的抗病相关候选R基因NtRRS-2和NtRRS-3。克隆全长cDNA,并通过构建超表达载体和RNAi载体转化烟草研究其抗青枯病功能,为后续烟草抗青枯病转基因工程奠定基础。主要研究结果如下:1.在前期烟草基因芯片分析筛选了一个在抗、感品种中均上调表达的抗青枯病相关R基因NtRRS-2,qRT-PCR验证其在抗、感品种接种青枯病菌后的表达模式,结果显示和芯片杂交结果一致,即该基因在抗青枯病烟草品种岩烟97中受青枯菌诱导上调表达,在感青枯病品种红花大金元中先上调表达后在48 h略下调。借助RACE技术,从岩烟97中克隆该基因的全长cDNA序列为3259 bp,编码938个氨基酸,其核苷酸序列及氨基酸序列与抗性品种K326较一致,而与感青枯烟草品种红花大金元的存在明显的序列差异。在本氏烟叶片上瞬间表达该基因与GFP融合蛋白,显示其定位于细胞膜上。qRT-PCR分析表明NtRRS-2受水杨酸(salicylic acid,SA)、茉莉酸甲酯(methyl jasmonic acid,JA)、脱落酸(abscisic acid,ABA)和乙烯(ethylene,ET)等不同激素诱导表达,在抗感青枯烟草品种中的表达特征存在明显的差异。瞬间超表达NtRRS-2基因引起过敏性死亡,并激活相关防御基因的上调表达。超表达NtRRS-2转基因烟草红花大金元对青枯菌的抗性增强,RNAi干扰NtRRS-2转基因烟草岩烟97对青枯菌表现感病但不显著。接种青枯菌后,超表达转基因植株中相关防御基因受诱导显著上调表达,而在RNAi转基因植株中相关防御基因受诱导后则显著下调表达;显示该基因主要通过激活防御系统而提高转基因烟草的抗青枯病。2.从烟草基因芯片分析筛选了另一个抗青枯病相关R基因NtRRS-3,其在抗病品种中对青枯菌接种表现上调表达,而在感病品种中下调表达。利用RACE技术,从岩烟97中克隆该基因的全长cDNA序列为3016 bp,编码902个氨基酸,其核苷酸序列及氨基酸序列在抗感青枯烟草品种岩烟97和红花大金元中序列分化不明显,但与中抗品种K326中的序列差异较大。在洋葱内表皮细胞上瞬间表达该基因与GFP融合蛋白,结果显示其定位于细胞核内。基因表达模式分析结果显示,NtRRS-3在抗感品种中受青枯菌诱导的表达特征不同;且该基因在受SA、JA、ABA和ET等不同激素诱导的抗感青枯烟草品种中的表达特征存在明显差异。在本氏烟草叶片瞬间超表达NtRRS-3基因不能引起过敏性死亡,但仍能激活相关防御基因的上调表达。NtRRS-3超表达载体转化感青枯病烟草红花大金元,明显增强对青枯菌的抗性,但其对青枯菌的抗性较弱于超表达NtRRS-2转基因烟草。NtRRS-3 RNAi干扰转基因烟草岩烟97对青枯菌表现明显的感病,而较于NtRRS-2 RNAi转基因烟草更易于感病。在接种青枯菌后,超表达转基因植株中相关防御基因受诱导显著上调表达,而在RNAi转基因植株中相关防御基因受诱导后显著下调表达。因此,NtRRS-3可能是参与了岩烟97的抗性通道。总的来说,NtRRS-2和NtRRS-3基因均具有对青枯菌的抗性,参与了烟草对青枯菌的抗病防御反应,且其信号调控网络由不同的抗性通路和SA,JA等介导的多条信号传导途径交叉形成。但二者在抗病反应中的功能有所不同,NtRRS-2在岩烟97青枯病抗性反应中并不是起到最关键作用;NtRRS-3可能是参与岩烟97青枯病抗性通道的重要基因。NtRRS-2和NtRRS-3基因的获得对于研究烟草抗青枯病相关基因的结构和功能具有重要意义,为烟草抗青枯病遗传育种奠定了基础。