【目的】1.听神经瘤是耳神经外科最为常见的侧颅底良性肿瘤,本课题拟从肿瘤临床生物学行为和分子生物学机制两个角度出发,全面探讨听神经瘤NF2基因的不同突变状态对肿瘤发展趋势的影响。通过基因层面、m RNA水平及蛋白水平全方位分析,探讨NF2致病基因突变失活所引起的一系列失调信号变化;通过体外细胞实验和体内动物实验,探讨靶向阻断或逆转这些失调信号对听神经瘤细胞生长特性的影响及并深入探讨具体机制。2.同时,我们还对侧颅底肿瘤的另一多见类型（副神经节瘤）的临床行为、遗传学机制以及表观遗传学机制进行关联性研究,以上研究可能为临床上侧颅底良性肿瘤的两种常见类型的治疗开辟新的途径。【方法】1.收集282例散发性听神经瘤的临床资料,按照诊断年龄分为31例青少年组听神经瘤（小于30岁）、181例成年组听神经瘤（30-60岁）和53例老年组听神经瘤（大于60岁）,对肿瘤临床特性（包括性别、侧别、发病年龄、症状持续时间、肿瘤大小及肿瘤性质）进行对比分析。利用巢式PCR扩增目的基因后直接测序结合多重连接依赖探针扩增技术（MLPA）的方法,对患者血液和肿瘤组织的NF2基因全编码序列（包括侧翼序列）的点突变和基因拷贝状态进行检测。利用Western-Blot技术和Realtime-PCR技术对不同NF2基因状态听神经瘤组织进行基因层面和蛋白表达水平的关联性分析。2.培养正常人类神经鞘膜细胞（HSC）和原代听神经瘤细胞,通过慢病毒转染技术沉默NF2基因产物merlin表达以分别模拟听神经瘤发生和发展。通过Western Blot技术和免疫荧光技术分析上述瘤变模型的关键蛋白p53-MDM2、cyclin D1表达水平及细胞亚定位变化,并在肿瘤组织中做进一步验证。3.通过分别沉默和过表达HSC细胞NF2基因和p53基因,结合Western Blot技术、Realtime-PCR和荧光酶素技术,全面探讨merlin与p53-MDM2相互作用的具体机制。4.体外培养大鼠神经鞘膜瘤细胞株（RT4）,通过体外应用p53激活剂Nutlin-3,探讨MDM2抑制对merlin-p53信号表达及亚细胞定位的影响;通过培养不听神经瘤原代细胞,探讨不同NF2基因状态的肿瘤细胞对Nutlin-3的敏感性差异及潜在机制;对比分析单用Nutlin-3和联合应用Nutlin-3/MG-132对听神经瘤细胞株RT4细胞和听神经瘤细胞生长活性以及关键蛋白表达的影响,并通过建立RT4细胞裸鼠模型进一步明确体外细胞实验结果。5.收集37例副神经瘤患者的临床资料,利用巢式PCR扩增目的基因后直接测序的方法,对所有患者血液和肿瘤组织的SDHx基因全编码序列点突变进行检测。临床资料和突变数据两方面结合,评估SDHx突变对肿瘤临床行为的影响;利用Methylation-specific PCR（MSP）技术对不同生物学行为肿瘤一系列抑瘤基因（p16,HIC1,Dc R1,Dc R2,DR4,DR5,CASP8,HSP47,MGMT,RASSF1A）的Cp G岛的甲基化修饰状态进行分析。【结果】1.对38例年轻人听神经瘤及53例老听神经瘤患者的肿瘤生长速度的主要衡量指标（肿瘤大小和症状持续时间）与发病年龄具有密切相关性。年轻人听神经瘤（24.1±4.9 years,n=38）相对于老年人听神经瘤（64.7±3.9 years,n=53）发病年龄更早（22.4 years vs.60.3 years;p=0.001）、诊断时肿瘤更大（mean 34.3 mm vs.23.6 mm;p=0.001）以及症状持续时间更短（1.6 years vs.4.4 years;p=0.026）。2.年人听神经瘤的NF2基因点突变检测进行检测发现,54（59.3%）患者存在NF2基因的体细胞突变,且两年龄组患者的突变发生率相近。结合基因拷贝状态检测,在年轻人肿瘤中,NF2基因存在两次打击（点突变+LOH）的比例为75.0%（21/28）,远高于老年人肿瘤的41.3%（12/29,p=0.012）。3.分别对15例不同基因状态听神经瘤组织进行merlin蛋白表达分析发现,NF2基因两次打击肿瘤的merlin蛋白表达完全缺失,而只存在单次打击（仅有点突变）的肿瘤存在残存merlin蛋白表达。4.慢病毒转染沉默神经鞘膜细胞系HSC细胞和原代听神经瘤细胞merlin表达后,细胞生长增殖更为活跃,周期蛋白cyclin D1表达升高,p53蛋白水平下降,伴随MDM2蛋白水平异常升高。在听神经瘤组织中merlin与p53存在“共表达”现象,merlin相对与正常神经表达下降,p53同样存在普遍缺失,而cyclin D1高表达,MDM2异常表达,此结果与上述HSC细胞merlin沉默表达后的相关信号变化相呼应。5.通过神经鞘膜细胞系HSC和正常神经（正常对照）、肿瘤组织和原代肿瘤细胞merlin、p53、MDM2以及cyclin D1关键蛋白的亚细胞定位分析发现,正常神经鞘膜细胞merlin蛋白表达位置与肿瘤细胞的位置一致（细胞质膜）,p53蛋白在神经鞘膜细胞中表达于细胞核中,而肿瘤组织p53蛋白蛋白弥散于细胞质中,MDM2蛋白在正常鞘膜细胞和肿瘤细胞的表达位置较为一致（细胞核）。细胞周期蛋白cyclin D1在正常神经中表达于细胞核中,而在肿瘤组织中表达于细胞质中。6.神经鞘膜细胞系HSC的NF2基因和P53基因沉默实验和过表达实验表明,merlin和p53蛋白两者之间存在相互正调节,相对于两者明显的蛋白水平变化,其m RNA表达水平变化无明显差异。通过荧光素酶实验分析,P53基因过表达后NF2基因的m RNA表达水平同样无明显变化。7.p53激活剂nutlin-3对听神经瘤细胞株（RT4）和听神经瘤原代细胞生长活性的抑制作用随药物浓度增大而不断加强。Nutlin-3抑制细胞作用可能通过p53和merlin蛋白水平上调,以及cyclin D1水平的下降,但p53和merlin蛋白m RNA表达水平无明显变化。通过细胞亚定位分析发现,Nutlin-3介导能p53和merlin蛋白在肿瘤细胞中由细胞质穿梭至细胞核中。8.p53激活剂Nutlin-3对不同NF2基因状态的听神经瘤原代培养细胞对生长抑制效果存在明显的差异性。Merlin蛋白完全缺失的听神经瘤细胞对Nutlin-3的敏感性较Merlin蛋白仍有表达的肿瘤细胞更差,蛋白分析发现前者在相同药物作用条件下p53蛋白升高的敏感性更差。9.通过在神经鞘膜瘤细胞株RT4细胞联合应用Nutlin-3/MG-132的方法,能获得相对于单用Nutlin-3更好的抑瘤效应,更高的p53蛋白信号升高水平。在Merlin蛋白完全缺失的原代听神经瘤细胞中,Nutlin-3/MG-132联合应用能获得良好的效果,具体机制表现为药物联用能明显上调merlin-p53共表达信号的蛋白水平。在RT4细胞动物模型的药物治疗中,Nutlin-3/MG-132联合能明显抑制肿瘤的生长。10.在37例副神经瘤的遗传学研究中,10例患者肿瘤组织中存在SDHx基因的点突变,这些点突变同样能在相应血液组织中验证。通过临床资料对比发现存在SDHx基因的肿瘤具有发病年龄更早（36.2±6.5 vs 47.0±8.1 years,P<0.01）、肿瘤大小更大（41.0±9.7 vs 36.9±9.3 mm,P=0.244）及更多发（80%vs3.7%,P<0.01）的特点。在10例SDHx突变的肿瘤和10例无突变肿瘤组织MSP分析发现,6个基因包括HIC1（45%）,Dc R1（35%）,Dc R2（50%）,DR4（75%）,DR5（50%）和CASPS8（55%）Cp G岛在副神经节瘤存在高频率异常甲基化;SDHx突变组肿瘤异常甲基化的抑瘤基因的数量明显高于SDHx非突变组（MI值,0.45±0.12 vs 0.24±0.13,P=0.001）,其中4个基因在两组中存在甲基化频率差异性（HIC1,60 vs 30%,P=0.185;Dc R1,60 vs 10%,P=0.029;Dc R2,70 vs 30%,P=0.089;CASPS8,80 vs 30%,P=0.035）。【结论】1.听神经瘤的发生与NF2基因突变密切相关,不同散发性听神经瘤的临床生物学行为存在较大的差异性,生长较快的肿瘤NF2基因双等位基因完全突变失活（点突变+LOH或2次点突变）发生的频率更高,提示merlin蛋白完全缺失的听神经瘤相对于merlin蛋白残存的听神经瘤生长更具侵略性,从而我们在基因/蛋白层面和听神经瘤临床行为之间建立了关联性。2.在听神经瘤细胞中merlin与p53蛋白存在“共表达”现象,听神经瘤发生过程中merlin蛋白表达水平缺失或下降导致的MDM2异常表达（核内积聚）、p53蛋白下调（胞质弥散、稳定性下降）,继而导致的merlin水平进一步下降所形成正反馈失调信号环路,能介导细胞周期进展（cyclin D1升高,迁移至胞质）,可能解释听神经瘤发病机制。3.通过药物在听神经瘤细胞株和原代肿瘤细胞中靶向激活p53信号阻断这种失调信号环路,并在蛋白水平上恢复merlin蛋白水平,实现merlin-P53抑瘤信号在蛋白水平上的共表达,最终达到有效控制听神经瘤生长的目的。然而不同NF2基因状态的听神经瘤细胞对P53激活剂Nutlin-3的敏感性存在较大的差异性,通过药物联合应用特异性蛋白酶抑制剂MG-132能缩小这种差异性,可能适合绝大多数听神经瘤的治疗。4.副神经节瘤SDHx基因的生殖细胞突变能作为肿瘤生长速度和恶性行为的遗传学标志,通过风险人群（如具有该疾病家族史）的血液基因检测,可能预测肿瘤生长趋势和临床行为的“良恶性”。此外,SDHx基因突变肿瘤存在一系列抑瘤基因的高频率异常甲基化。甲基化修饰不同于SDHx基因突变,前者具有药物干预逆转的可能性,进一步研究可能明确关键的干预靶点,从而为副神经瘤的药物治疗提供可能性。