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目的近年来,因建筑交通行业的迅猛发展和人口老龄化的加剧所导致的骨折严重危害着我们的健康,促进骨折的愈合、注意避免发生骨折延迟愈合或不愈合仍是我们医学界面临的一个挑战。低强度脉冲超声(Low intensity pulsed ultrasound,LIPUS)以费用低廉、无感染、无创伤、治疗简单、无不良反应、效果理想受到人们的关注,然而,LIPUS促进骨愈合的作用机制目前仍不明确。我们分析LIPUS促进骨愈合的关键是LIPUS通过加速BMSCs多向分化来实现修复受损骨组织。因此,本课题我们将研究LIPUS对BMSCs多向分化的影响,计算LIPUS可以提高BMSCs分化的分化率。并将在动物实验中,初步观察LIPUS联合BMSCs治疗骨缺损的可行性。方法1.BMSCS细胞分八个实验组:对照组、成骨诱导组、血管内皮诱导组、双诱导组、超声组、成骨诱导+超声组、血管内皮诱导+超声组、双诱导+超声组。超声组、成骨诱导+超声组、血管内皮诱导+超声组、双诱导+超声组细胞使用低强度脉冲超声仪(LIPUS频率0.6MHz,重复频率1kHz,占空比20%)以0.03W/cm2的强度每天辐照20min,连续辐照13d;其余四组使用同样方法进行超声假照。所有实验组细胞均于0d、1d、3d、7d、9d、11d、13d进行mtt检测细胞增殖活性,于5d、9d、13d取样本进行以下检测:倒置显微镜观察细胞形态、、透射电镜观察细胞超微结构变化、激光共聚焦检测细胞成骨和血管内皮分化情况、流式细胞表面抗原检测细胞分化率,荧光pcr检测骨钙素和vwf基因的表达。2.将24只雌性sd大鼠随机分为四组:对照组,lipus组,bmscs组和bmscs+lipus组。用直径1.6mm的骨穿针建立统一的大鼠骨缺损“孔”状模型。造模当天各组开始分别进行治疗,连续观察4周,并于治疗2周、4周后对各组大鼠进行x线成像、股骨样本采图和he染色等检测。结果1.细胞形态观察、电镜检测和共聚焦检测显示lipus辐照后的各组细胞,开始分化的时间要早于对应假照组,细胞向特定诱导方向分化的数量也多于对应假照组。流式表面抗原检测显示超声组细胞分化率达到(11±0.11),对照组分化率为(5.95±0.05),两组间差异具有显著性(p<0.05);成骨+超声组细胞分化率达到(17.58±0.046),成骨组分化率为(10.39±0.08),两组间差异具有显著性(p<0.05);血管内皮+超声组细胞分化率达到(99.46±0.05),血管内皮组分化率为(96.97±0.03),两组间差异具有显著性(p<0.05);双诱导+超声组细胞分化率达到(34.79±1.21),双诱导组分化率为(24.77±0.3),两组间差异具有显著性(p<0.05)。荧光pcr结果显示,不论骨钙素基因还是vwf基因,所有超声组的表达均明显高于其对应的假照组,除了第5天成骨与成骨+超声组vWF基因表达、血管内皮组与血管内皮+超声组OC基因表达没有差异性(P>0.05)外,其余各组均是LIPUS作用后细胞OC基因和vWF基因的表达高于其对应的未进行LIPUS辐照的实验组的基因,且差异具有显著性(P<0.05)。2.LIPUS与BMSCs联合治疗大鼠骨缺损,结果显示,LIPUS组与BMSCS组治疗骨愈合均效果,两组之间愈合情况差异不大,测试两组未愈合骨组织表面积显示两组间无显著性差异(P>0.05),但HE染色检测中可以发现两组的新生骨骨质不如周边正常骨。联合治疗组骨愈合情况明显优于LIPUS组和BMSCS组,4周时缺损处骨组织基本修复,统计未愈合组织面积后与LIPUS组和BMSCS相比具有极显著性差异(P<0.01)。且根据HE染色结果来看,该组新生薄片骨骨组织排列整齐统一,还有新生血管生成。结论1.LIPUS可以加速BMSCs向成骨和血管内皮方向分化,使其更快生成骨组织和血管组织。在双向同时诱导BMSCs时,可以看到BMSCs同时分化出血管和骨组织,这为以后生成血管化骨组织提供研究基础。在双向同时诱导条件下,LIPUS对BMSCs分化率的提高作用最明显。2.LIPUS联合BMSCs治疗骨愈合的效果最好,联合治疗不仅可以明显缩短骨愈合时间,其新生骨骨质也与正常骨相差不大。超声辐照4周后,HE染色图片中在骨缺损新生骨周围还观察到新生血管,证明LIPUS可以促进BMSCs双向同时分化。