随着人口增长和老龄化进程的加快,在过去的20年间,癌症的发病率大大地增加。有效的疾病筛查和早期诊断越来越受到人们重视。因其特异性好、灵敏度高等特点免疫分析成为癌症早期诊断的有效手段。但传统的免疫分析方法本身的局限性大大限制了其进一步应用。例如,天然酶的昂贵及性质脆弱不易保存;常规比色免疫分析的显色结果是单一颜色从浅到深或从深到浅,当光强度相近时,很难用肉眼区分。本课题基于纳米材料特异的理化性质和良好的生物相容性等优势,开发肉眼可读的半定量比色检测方法,并进一步利用纳米材料放大检测信号提高分析的灵敏度,降低检出限。本课题的主要研究内容及结果如下:1、构建纳米金催化铜沉积介导的浓度依赖多色转变免疫分析本实验利用纳米金介导的铜沉积来实现检测信号的放大以取代昂贵且脆弱的生物酶。通过加入三价铁(Fe3+)、铁氰化钾(K3Fe(CN)6)作为显色剂,调控显色剂的浓度等条件,产生浓度依赖的多色转变,实现肉眼快速判读。本实验以兔IgG作为模型目标分析物,采用三明治夹心法构建浓度依赖的多色转变比色免疫分析。当待测液中没有兔IgG,纳米金标记的抗体不会连接到固相载体上,因而不会有纳米金介导的铜沉积,加入显色剂后也不会有普鲁士蓝生成,溶液颜色为黄色。随着兔IgG浓度的增大,越来越多的纳米金被连接到固相载体上,因此越来越多的铜单质被沉积到纳米金表面,最后加入显色剂后,会生成更多的普鲁士蓝。普鲁士蓝和K3Fe(CN)6以不同比例混合时,溶液的颜色会随着普鲁士蓝浓度的增大逐渐的变为绿色、蓝绿色、蓝色。即使在待测物浓度相近时,这种浓度依赖的多种颜色的转变更容易通过肉眼进行区分,从而实现灵敏而准确的半定量测定。也可通过测定708nm处的吸收值,绘制标准曲线,实现未知样品中兔IgG的定量检测。在最优条件下,本实验获得了兔IgG的检测线性范围为1pg mL-1到100 ng m L-1,最低检测限为0.27 pg mL-1。2、构建基于磁性纳米粒子标记与信号放大的高灵敏比色免疫分析方法本方法中通过水热法制备了柠檬酸包被的磁性三氧化二铁纳米颗粒,并通过其表面的羧基与检测抗体进行耦联以代替传统的酶标抗体。构建三明治夹心免疫分析法,以兔IgG作为模型蛋白。当待测物中兔IgG越多,通过夹心免疫反应连接到固相载体上的磁性纳米粒子标记的检测抗体就越多。最后加入抗坏血酸(AA)、红菲绕啉(BPT)作为显色液,其中酸性且具有还原性的AA腐蚀磁性纳米颗粒,释放少量亚铁离子(Fe2+),Fe2+进一步与BPT形成红色可溶性络合物实现显色。本体系中,随着兔IgG浓度的增大,更多的磁性纳米粒子被捕获,并生成更多的红色络合物,溶液颜色随之逐渐加深,同时吸光值也随之增大。在最优条件下,本实验获得的兔IgG的线性检测范围为从100pg mL-1到1μg m L-1,最低检出限可达5.5pg m L-1。3、选择肿瘤标志物作为模型蛋白,评价所开发的比色免疫分析法在实际检测中的应用潜力为进一步探讨上述方法在临床检测中的应用潜能,我们选取了前列腺癌标志物前列腺特异性抗原(Prostate specific antigen,PSA)作为模型蛋白,采用标准加入法向人血清中加入已知浓度的标准品,用构建的纳米金催化铜沉积介导的比色免疫分析法进行检测。结果表明,本方法对PSA的检出限远低于正常人血清中的含量,而且标准加入法获得了较好的回收率。另外,我们选取了癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen,CEA)作为模型蛋白,用磁珠标记二抗的比色分析方法进行检测。在牛血清中验证本方法检测CEA的特异性和选择性并得到了满意的结果。综上所述,本课题基于纳米材料的特性开发了两种应用于肿瘤标志物检测的比色免疫分析法,在缓冲液中实现了高灵敏度、高特异性的比色分析,同时在模拟样品中也得到了满意的结果。另外,通过简单调整识别分子,本方法也同样适用于其他生物大分子或小分子的检测。