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研究目的:观察过氧化氢(H2O2)诱导的体外原代培养皮层神经元损伤中,过氧化物酶体增殖物激活受体g(PPARg)的表达及活性改变,以及PPARg激活或抑制对神经元过氧化氢损伤产生的影响,探讨PPARg对神经元氧化应激损伤的保护作用。实验方法:1、原代培养皮层神经元:取出生24h之内Sprague-Dawley新生鼠皮层神经元细胞进行体外原代培养,培养7天(d7)进行纯度鉴定,并用于各种处理和检测。2、神经元过氧化氢损伤模型:以不同浓度的过氧化氢作用于d7神经元,于不同作用时间后进行评价,选取合适浓度及作用时间应用于后续实验。3、细胞形态学观察:包括光镜下观察,即将不同组别细胞置于将倒置相差显微镜下,观察其形态变化,并采集图像;神经元MAP2免疫荧光染色,即用MAP2抗体标记神经元,荧光显微镜下观察不同组别细胞形态完整性的改变,并采集图像。4、MTT比色法检测细胞相对存活率,即检测不同组别神经元经处理后细胞活性的改变。5、分别提取总蛋白和核蛋白,Western blotting法检测不同组别细胞内PPARγ、p-PPARγ(磷酸化PPARγ)、p-ERK1/2(磷酸化ERK1/2,即ERK1/2的活性形式)、Bcl-2、活化的Caspase-3、Nrf2的表达水平。6、qRT-PCR法观察PPARγ靶基因:提取不同组别神经元RNA,qRT-PCR技术对PPARγ靶基因表达水平进行检测。7、ELISA法检测PPARγ-DNA结合活性:应用PPARγ转录因子分析试剂盒检测不同组别神经元PPARγ与过氧化物酶体增殖物反应元件(PPRE)的结合活性。8、反义寡核苷酸法降低神经元PPARγ:用PPARγ反义寡核苷酸处理原代培养d7神经元细胞,抑制PPARγ表达。实验结果:1、体外培养正常皮层神经元2d后,大多细胞呈圆形或椭圆形,可见较细小的细胞突起,至第7天时神经元胞体立体感强,形态饱满,突起变长且增粗,并相互交织成网。用神经元特异性抗体微管相关蛋白2(MAP2)对进行免疫荧光染色,鉴定神经元阳性率达95%以上,是相对纯的神经元培养,可用于后续实验。2、将过氧化氢作用于神经元,可造成神经元损伤,轻者细胞肿胀变圆,细胞突起断裂或消失;重者细胞发生崩解,可见较多细胞碎片,并呈现剂量-时程依赖效应。选取浓度为500mM、作用6~24小时进行后续实验。3、过氧化氢抑制神经元PPARg蛋白表达,同时增加PPARg灭活;抑制ERK1/2激活可以拮抗过氧化氢对PPARg的灭活作用。4、外源性给予PPARg激动剂罗格列酮减轻神经元过氧化氢损伤、增加Bcl-2及Nrf2表达,同时抑制活化的Caspase-3表达;而PPARg抑制剂GW9662可以拮抗罗格列酮的保护作用、降低Bcl-2及Nrf2表达、增加活化的Caspase-3表达。5、降低PPARg表达,对正常基础状态下的神经元形态和存活率无明显影响,但使神经元对过氧化氢损伤更敏感,增加过氧化氢诱导的Bcl-2、Nrf2、活化的Caspase-3表达的改变,同时可以降低外源性给予PPARg激动剂罗格列酮所产生的保护作用。实验结论:1、在体外原代培养皮层神经元中,过氧化氢可能通过负性调节PPARg(即表达下调和活性降低)引起神经元损伤。2、在体外原代培养皮层神经元中,外源性激活PPARγ可以保护神经元过氧化氢损伤,而神经元自身PPARγ的表达可能是神经元自我保护机制之一。3、PPARγ的神经保护作用可能部分通过抑制活化的Caspase-3、上调Bcl-2抗凋亡蛋白,以及增加抗氧化应激转录因子Nrf2的表达实现的。