论文部分内容阅读
在能量负平衡状况下,围产期奶牛启动脂肪动员以满足机体能量的需求,而脂肪动员产生的大量非酯化脂肪酸（NEFA）会使甘油三酯在肝脏蓄积,导致脂肪肝的形成。而且能量负平衡下高浓度NEFA引起的肝脂肪蓄积与胆固醇合成不足有关,影响极低密度脂蛋白（VLDL）组装,且VLDL是将甘油三酯运出肝外的主要方式。然而在能量负平衡下奶牛肝脏胆固醇代谢调节机制仍未清晰,而探究胆固醇对能量负平衡导致的肝脂沉积的调控代谢机制对阐明围产期奶牛脂肪肝发病机理及完善其防治措施有重要意义。因此,本试验以高NEFA介导犊牛原代肝细胞脂质蓄积为模型,添加/抑制胆固醇合成,分析胆固醇肝脂代谢相关指标特征,以期阐明胆固醇在高NEFA介导犊牛肝细胞脂质蓄积的代谢调控机制,对健全围产期奶牛脂肪肝发病机理有重要意义,为临床防治奶牛脂肪肝研究提供理论依据。本试验首先研究高NEFA介导犊牛肝细胞胆固醇及脂肪酸代谢特征。通过对围产期正常奶牛和患有脂肪肝奶牛进行肝脏穿刺,以及用1.2 m M NEFA刺激犊牛原代肝细胞12h,检测脂肪酸合成和胆固醇合成代谢相关指标。为阐明胆固醇在高NEFA介导犊牛肝细胞脂质沉积中代谢调控机制,试验在1.2 m M NEFA介导的犊牛原代肝细胞脂质沉积模型基础上,通过分别添加10μM MβCD-CHO（β环糊精-胆固醇）、100μM MβCD-CHO、10μM胆固醇合成抑制剂SIM、6μM胆固醇转运抑制剂U18666A刺激12 h,检测脂肪酸合成、胆固醇合成代谢、氧化应激相关指标。体内试验结果显示,脂肪肝奶牛肝脏脂肪酸合成因子SREBP-1c、FAS、ACC1表达极显著升高,胆固醇敏感元件SREBP-2c、HMGCR、ACAT2 m RNA表达水平显著的降低（p<0.05或p<0.01）。体外试验结果显示,与对照组相比,NEFA组SREBP-1c、FAS、ACC1表达极显著升高,细胞TG和脂滴含量显著升高,而SREBP-2c、HMGCR、ACAT2、MTP、APOB100、ABCA1、ABCG5、ABCG8和CYP27A1表达显著降低,TC含量有所降低（p<0.05或p<0.01）,表明在高NEFA介导犊牛肝细胞脂质沉积增加,胆固醇合成、转运和排出减少,VLDL的合成减少。在添加10、30、60、100μM MβCD-CHO刺激细胞时,细胞的SREBP-1c、FAS、ACC1 m RNA表达水平、TG和脂滴含量随CHO剂量依赖性增大,筛选出10μM和100μM MβCD-CHO进行后续试验。与NEFA组相比,10μM MβCD-CHO+NEFA组SREBP-1c、FAS、ACC1表达显著降低,MTP、APOB100、ACAT2表达显著升高,细胞内TC、CE和细胞上清APOB100含量显著升高,TG含量和脂滴含量显著减少（p<0.05或p<0.01）;ABCA1、ABCG5、ABCG8、CYP27A1表达显著升高（p<0.05或p<0.01）;SOD活性显著升高、MDA含量、ROS水平显著下降（p<0.05）,表明10μM MβCD-CHO促进高NEFA介导的VLDL代谢相关基因的表达和胆固醇的转运,缓解NEFA介导的脂质沉积,降低氧化应激水平。但添加100μM MβCD-CHO的结果与10μM MβCD-CHO组相反,这表明100μM MβCD-CHO加重NEFA介导的脂质沉积及氧化应激水平,减少VLDL代谢相关基因的表达和胆固醇的转运。与NEFA组相比,SIM+NEFA组SREBP-1c、FAS、ACC1表达显著降低,SREBP-2c、HMGCR、MTP、ACAT2、APOB100表达显著升高,细胞内TC、CE和细胞上清APOB100含量显著升高（p<0.05或p<0.01）,TG含量和脂滴含量有所降低;ABCG5、ABCG8、CYP27A1的表达显著上升,ABCA1表达显著降低（p<0.05或p<0.01）;SOD活性显著升高、MDA含量、ROS水平显著下降（p<0.05或p<0.01）,表明SIM可降低高NEFA介导的脂肪酸从头合成,减少脂肪酸氧化,降低ABCA1介导的胆固醇-高密度脂蛋白转运,促进ABCG5介导的胆固醇-胆汁酸代谢。U18666A+NEFA组SREBP-2c、HMGCR、ACAT2、APOB100 m RNA表达水平显著升高,细胞内TC含量显著升高,TG含量和脂滴含量有所升高,细胞上清APOB100含量显著降低（p<0.05）;ABCA1、ABCG5、ABCG8、CYP27A1表达显著降低（p<0.05或p<0.01）;SOD活性显著下降、MDA含量、ROS水平显著升高（p<0.05）,表明U18666A可通过抑制细胞内胆固醇转运、代谢,抑制VLDL组装分泌加重NEFA介导的脂质沉积,加重了氧化应激。综述所述,能量负平衡奶牛高NEFA介导的脂质沉积中发生胆固醇代谢紊乱,添加低浓度的胆固醇可有效缓解NEFA介导的脂质沉积,促进了VLDL代谢相关基因的表达和胆固醇的转运,减轻肝细胞氧化应激。