【摘 要】
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植物在生长发育过程中会受到多种非生物胁迫的影响,包括镉(Cd)、汞(Hg)、铜(Cu)等重金属胁迫。其中,Cd作为植物生长非必需且有毒的元素,较低的含量就会对植物造成毒害作用。番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)作为重要的蔬菜作物之一,具有较高的营养价值和一定的药用价值。随着我国近年来设施生产规模的不断扩大,栽培地土壤质量退化严重,重金属在作物中的大量累积严重影响食品
【基金项目】
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黑龙江省自然科学基金联合引导项目LH2021C052;
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植物在生长发育过程中会受到多种非生物胁迫的影响,包括镉(Cd)、汞(Hg)、铜(Cu)等重金属胁迫。其中,Cd作为植物生长非必需且有毒的元素,较低的含量就会对植物造成毒害作用。番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)作为重要的蔬菜作物之一,具有较高的营养价值和一定的药用价值。随着我国近年来设施生产规模的不断扩大,栽培地土壤质量退化严重,重金属在作物中的大量累积严重影响食品安全,危及动物和人类健康。因此,研究番茄响应Cd胁迫的分子机制进而筛选植株抗Cd相关基因迫在眉睫。组蛋白去甲基化酶(JHDM)是一类只含有Jmj C结构域的蛋白家族,近些年来,对其参与非生物胁迫(干旱,冷害,盐胁迫)方面的研究较多,但在植物应对重金属胁迫方面还鲜有报道。本文以番茄为试验材料,分别克隆出SlJMJ18和SlJMJ23基因的CDS区和启动子区域,并对拟南芥进行遗传转化,初步探究该基因在番茄响应重金属胁迫中的作用。这对于研究组蛋白去甲基化酶基因(SlJMJs)在番茄抵抗重金属胁迫过程中的分子机制提供理论依据和基因资源。本试验结果表明:1.镉胁迫下筛选番茄JMJs基因家族响应基因依据拟南芥和水稻中已报道的JMJs家族相关基因的功能,选择番茄中同一亚家族的相关基因(共计9个成员)进行研究。通过半定量和荧光定量PCR的方法鉴定出响应重金属Cd胁迫的6个基因,分别为SlJMJ2,SlJMJ9,SlJMJ18,SlJMJ20,SlJMJ23和SlJMJ524。本文最终选择SlJMJ18和SlJMJ23基因进行深入研究。2.SlJMJ18和SlJMJ23基因的克隆及生物信息学分析通过克隆获得番茄SlJMJ18和SlJMJ23基因,序列分析结果显示,这两个基因的CDS区全长为1 134 bp和1 530 bp,各自编码377个和509个氨基酸。这两个蛋白具有复杂的三级结构,均含有Jmj C保守结构域,符合Jmj C domain-only基因家族的结构特征。进一步通过进化树分析可知,这两个蛋白分属于不同的亚家族,同一亚家族中的成员在Jmj C域序列和结构上相对保守。3.SlJMJ18和SlJMJ23基因在非生物胁迫下的表达分析研究表明,SlJMJ18和SlJMJ23基因在番茄的各个组织中均有不同程度的表达,SlJMJ18基因在花中表达量最高,SlJMJ23基因在幼叶中表达量最高。并且,这两个基因对重金属Hg,Pb,Cu胁迫均有响应。另外,通过生物信息学分析发现,SlJMJ18和SlJMJ23基因的启动子全长分别为2 053 bp和2 202 bp,启动子序列中均包含大量与非生物胁迫(ARE,GC-motif,LTR)、植物激素应答(ABRE,Pbox,TGACG-motif)、光响应(AE-box,Box4,G-box)相关的调控元件。进一步通过GUS染色,SlJMJ18基因在Cd,Hg,Cu胁迫6 h时诱导增强表达,SlJMJ23基因在Cd,Hg,Cu,干旱,甘露醇和盐胁迫的不同时间点均受诱导表达。4.SlJMJ18和SlJMJ23转基因拟南芥植株的功能验证4.1 SlJMJ18过表达拟南芥植株在成苗期表现出早花现象SlJMJ18-OE在萌发期和幼苗期均显示出Cd耐受性表型,而成苗期却显示出早花表型,通过对激素(独脚金内酯,油菜素内酯,脱落酸)相关基因表达分析推测,过表达植株中油菜素内酯和脱落酸的拮抗作用可能与植株的生长异常有关。4.2 SlJMJ23转基因植株在发育的不同时期对Cd的响应有所不同SlJMJ23-OE在萌发期表现出Cd敏感表型(与SlJMJ18-OE表型相反),在幼苗期和成苗期则显示出对Cd胁迫的耐受性。进一步研究表明,SlJMJ23-OE在幼苗期,金属转运蛋白相关基因的表达量显著降低,体内的激素含量也发生了显著变化,这可能在一定程度上影响了植株对Cd的吸收。另外,在成苗时期,SlJMJ23-OE可能是通过增加抗氧化能力和提高代谢相关产物(总酚)的合成来抵抗Cd胁迫。
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