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硼是植物生长发育所必需的微量矿质营养元素。土壤缺硼在全球范围内的农业生产中都是重要的问题，目前已有超过80个国家中的132种作物出现缺硼症状。甘蓝型油菜是世界上第三大食用植物油和第二大植物饲料蛋白质的来源，我国油菜产量十分依赖于硼肥的施用，素有“无硼不种油菜”的说法。但是硼矿石属于不可再生资源，而通过遗传改良的方式提高甘蓝型油菜的低硼耐受能力，在减少或者不施用硼肥的条件下，保持或者提高甘蓝型籽粒产量，则为我们提供了一条绿色可持续发展的道路。以往的研究表明不同的甘蓝型油菜品种在低硼耐受能力上存在巨大差异，但是其中的遗传基础还很不清楚。在本研究中，基于课题组前期硼高效QTL精细定位将BnaA3.NIP5;1确定为硼高效QTLqBEC-A3a的候选基因，首先对BnaA3.NIP5;1调控甘蓝型油菜低硼耐受的分子机制进行了探究，然后对甘蓝型油菜中BnaA3.NIP5;1和BnaA2.NIP5;1的功能差异和协同作用进行了分析。获得的主要结果如下：
(1)甘蓝型油菜硼高效基因BnaA3.NIP5;1的基因功能
在课题组前期将BnaA3.NIP5;1确定为硼高效主效QTLqBEC-A3a候选基因的基础上，我们证实了甘蓝型油菜的硼酸通道基因BnaA3.NIP5;1是甘蓝型油菜中调控低硼耐受的重要因子。首先通过遗传互补实验证实BnaA3.NIP5;1的差异表达调控了甘蓝型油菜硼高效品种青油10号(QY10)和低效品种Westar10(W10)中不同的低硼耐受能力。利用非洲爪蟾卵母细胞异源表达、组织、细胞、亚细胞定位、短期10B同位素吸收和LA-ICP-MS根尖硼原位分布等实验，证实了在低硼条件下BnaA3.NIP5;1特异地定位在根尖侧根冠细胞中远轴一侧(靠近土壤一侧)的细胞膜上，促进甘蓝型油菜根尖分生组织对硼的吸收，满足根尖对硼的需求，进而促进根系的生长发育，提高植物的低硼耐受能力。
(2)甘蓝型油菜硼高效基因BnaA3.NIP5;1差异表达的分子机制
通过对甘蓝型油菜硼高效亲本QY10和低效亲本W10中BnaA3.NIP5;1的启动子分离、分析，以及一系列的启动子截短，片段重组和碱基插入/缺失实验，发现BnaA3.NIP5;1的5’UTR中的一个CTTTC串联重复序列直接调控了BnaA3.NIP5;1的表达量，硼高效亲本QY10中一个CTTTC缺失使得其BnaA3.NIP5;1的表达量显著高于拥有两个CTTTC串联重复的低效亲本W10。
(3)BnaA3.NIP5;1的自然变异和育种应用
通过对甘蓝型油菜自然群体中的极端硼高效和低效材料BnaA3.NIP5;1启动子进行分离分析，发现BnaA3.NIP5;1Q单倍型材料BnaA3.NIP5;1的表达量显著高于BnaA3.NIP5;1W单倍型材料。相关性分析结果表明，甘蓝型油菜中BnaA3.NIP5;1的表达量与苗期的主根长以及成熟期的籽粒产量均成显著的正相关。缺硼田间试验结果显示硼高效优异等位位点BnaA3.NIP5;1Q能够很好地提高甘蓝型油菜在低硼条件下的籽粒产量，意味着BnaA3.NIP5;1Q在甘蓝型油菜的生长实践中具有较高的应用潜力。
(4)甘蓝型油菜BnaA3.NIP5;1和BnaA2.NIP5;1的功能差异和协同作用
NIP5;1是植物中重要的硼酸通道。通过系统进化分析，在甘蓝型油菜中鉴定到了5个BnaNIP5;1基因，而基因表达模式分析显示只有BnaA2.NIP5;1和BnaA3.NIP5;1在硼高效品种QY10的根系中具有较高的表达量。对BnaA3.NIP5;1进行特异RNAi，发现BnaA3.NIP5;1表达量特异性下降的QsRNAi转基因植株在缺硼条件下根系急剧缩短、叶片卷曲、生物量减小。对BnaA3.NIP5;1和BnaA2.NIP5;1进行保守RNAi，BnaA3.NIP5;1和BnaA2.NIP5;1表达量同时下降的QmRNAi转基因植株在缺硼条件下出现更为严重的缺硼症状，包括侧枝丛生、生长点坏死、生物量相较于QsRNAi转基因在植株进一步减小。盆栽试验结果表明，BnaA3.NIP5;1对于甘蓝型油菜成熟期的籽粒产量也具有重要的作用。原位RT-PCR结果显示，BnaA2.NIP5;1在根尖分生区的侧根冠，外皮层以及伸长区的外皮层细胞中均有表达，而BnaA3.NIP5;1则是特异地位于根尖分生区的侧根冠细胞中表达。
综上所述，本研究揭示了BnaA3.NIP5;1和BnaA2.NIP5;1在甘蓝型油菜中存在的功能分化，但两者都对甘蓝型油菜低硼条件下的生长发育具有重要作用。其中BnaA3.NIP5;1位于根尖分生区的侧根冠细胞中表达，促进根尖分生组织和植物根系的生长发育，发达的根系进一步利用位于外皮层细胞中表达的BnaA2.NIP5;1从土壤中吸收硼，进入根系中的硼则通过木质部导管转移到地上部，满足地上部生长发育对硼的需求。
(1)甘蓝型油菜硼高效基因BnaA3.NIP5;1的基因功能
在课题组前期将BnaA3.NIP5;1确定为硼高效主效QTLqBEC-A3a候选基因的基础上，我们证实了甘蓝型油菜的硼酸通道基因BnaA3.NIP5;1是甘蓝型油菜中调控低硼耐受的重要因子。首先通过遗传互补实验证实BnaA3.NIP5;1的差异表达调控了甘蓝型油菜硼高效品种青油10号(QY10)和低效品种Westar10(W10)中不同的低硼耐受能力。利用非洲爪蟾卵母细胞异源表达、组织、细胞、亚细胞定位、短期10B同位素吸收和LA-ICP-MS根尖硼原位分布等实验，证实了在低硼条件下BnaA3.NIP5;1特异地定位在根尖侧根冠细胞中远轴一侧(靠近土壤一侧)的细胞膜上，促进甘蓝型油菜根尖分生组织对硼的吸收，满足根尖对硼的需求，进而促进根系的生长发育，提高植物的低硼耐受能力。
(2)甘蓝型油菜硼高效基因BnaA3.NIP5;1差异表达的分子机制
通过对甘蓝型油菜硼高效亲本QY10和低效亲本W10中BnaA3.NIP5;1的启动子分离、分析，以及一系列的启动子截短，片段重组和碱基插入/缺失实验，发现BnaA3.NIP5;1的5’UTR中的一个CTTTC串联重复序列直接调控了BnaA3.NIP5;1的表达量，硼高效亲本QY10中一个CTTTC缺失使得其BnaA3.NIP5;1的表达量显著高于拥有两个CTTTC串联重复的低效亲本W10。
(3)BnaA3.NIP5;1的自然变异和育种应用
通过对甘蓝型油菜自然群体中的极端硼高效和低效材料BnaA3.NIP5;1启动子进行分离分析，发现BnaA3.NIP5;1Q单倍型材料BnaA3.NIP5;1的表达量显著高于BnaA3.NIP5;1W单倍型材料。相关性分析结果表明，甘蓝型油菜中BnaA3.NIP5;1的表达量与苗期的主根长以及成熟期的籽粒产量均成显著的正相关。缺硼田间试验结果显示硼高效优异等位位点BnaA3.NIP5;1Q能够很好地提高甘蓝型油菜在低硼条件下的籽粒产量，意味着BnaA3.NIP5;1Q在甘蓝型油菜的生长实践中具有较高的应用潜力。
(4)甘蓝型油菜BnaA3.NIP5;1和BnaA2.NIP5;1的功能差异和协同作用
NIP5;1是植物中重要的硼酸通道。通过系统进化分析，在甘蓝型油菜中鉴定到了5个BnaNIP5;1基因，而基因表达模式分析显示只有BnaA2.NIP5;1和BnaA3.NIP5;1在硼高效品种QY10的根系中具有较高的表达量。对BnaA3.NIP5;1进行特异RNAi，发现BnaA3.NIP5;1表达量特异性下降的QsRNAi转基因植株在缺硼条件下根系急剧缩短、叶片卷曲、生物量减小。对BnaA3.NIP5;1和BnaA2.NIP5;1进行保守RNAi，BnaA3.NIP5;1和BnaA2.NIP5;1表达量同时下降的QmRNAi转基因植株在缺硼条件下出现更为严重的缺硼症状，包括侧枝丛生、生长点坏死、生物量相较于QsRNAi转基因在植株进一步减小。盆栽试验结果表明，BnaA3.NIP5;1对于甘蓝型油菜成熟期的籽粒产量也具有重要的作用。原位RT-PCR结果显示，BnaA2.NIP5;1在根尖分生区的侧根冠，外皮层以及伸长区的外皮层细胞中均有表达，而BnaA3.NIP5;1则是特异地位于根尖分生区的侧根冠细胞中表达。
综上所述，本研究揭示了BnaA3.NIP5;1和BnaA2.NIP5;1在甘蓝型油菜中存在的功能分化，但两者都对甘蓝型油菜低硼条件下的生长发育具有重要作用。其中BnaA3.NIP5;1位于根尖分生区的侧根冠细胞中表达，促进根尖分生组织和植物根系的生长发育，发达的根系进一步利用位于外皮层细胞中表达的BnaA2.NIP5;1从土壤中吸收硼，进入根系中的硼则通过木质部导管转移到地上部，满足地上部生长发育对硼的需求。