根据我国第三次人体重点寄生虫病现状调查结果,推测我国感染华支睾吸虫的人数高达1520万人,感染病例占全世界的近50%。由于缺乏相应的疫苗以及人们的饮食习惯难以改变,药物化疗仍然是控制华支睾吸虫病的主要手段。研究表明,顿服吡喹酮对华支睾吸虫有较好的杀灭效果,这为华支睾吸虫的群体化疗用药提供希望。尽管吡喹酮以其高效低毒的特点作为治疗华支睾吸虫病的首选药物长达30余年,但是目前并没有明确的、科学的用药方案和治疗方法,并且目前临床上用于治疗华支睾吸虫感染的药物主要是消旋体(左旋体和右旋体各占50%)吡喹酮,尚未见到市售左旋吡喹酮,也未见到左旋吡喹酮杀灭华支睾吸虫的相关研究。研究表明左旋吡喹酮(左旋异构体)是该药的有效成分,右旋异构体几乎无杀虫作用,并且对心脏的毒性左旋异构体比右旋异构体低,右旋吡喹酮(右旋异构体)被认为是引起副作用的主要原因,同时也是造成药物发苦、气味难闻的原因之一。因此,获得左旋吡喹酮真实的杀灭华支睾吸虫效果以及确切的使用剂量无疑是当前最重要的任务。与此同时,我国土地的使用方式在过去几十年中发生了巨大的变化,进而导致了华支睾吸虫自然疫源地原有的生态环境也发生了巨大的变化。我国华南地区,尤其是珠江三角洲地区往日常见的桑基鱼塘、溪流以及湖泊等已很难一见,这直接导致了很难在野外获得科学研究所需的华支睾吸虫阳性鱼。如果完全依靠从华支睾吸虫自然疫源地采集小型淡水鱼来获得实验所需的华支睾吸虫囊蚴,不仅费时费力,还容易受到季节的影响,不能有效的满足科研工作的需要。综上所述,本文就如何在实验室内建立起一个科学合理、经济可行、易于操作、不受季节影响并且能够持续、及时的为科学研究提供足够囊蚴的完整的华支睾吸虫室内生活史循环进行了研究,并且在此基础上,通过实验室研究确定左旋吡喹酮对华支睾吸虫的杀灭效果,以确定该药物抗华支睾吸虫的量效关系,从而为该药物的临床应用提供科学依据。第一部分华支睾吸虫生活史在实验室的构建目的:1.研究华支睾吸虫虫卵在不同溶液中和不同温度下存活时间的差异,为华支睾吸虫虫卵的保存提供科学依据。2.研究华支睾吸虫第一中间宿主、第二中间宿主和终宿主的易感性差异以及最佳感染条件,为构建华支睾吸虫实验室内生活史循环提供科学依据。方法:1.25℃条件下华支睾吸虫虫卵在不同溶液中的存活时间收集活性良好的华支睾吸虫虫卵,在25℃条件下观察华支睾吸虫虫卵在去离子水、脱氯水、自来水、PBS缓冲液、0.9%NaCl溶液、阿氏液、25%甘油、1.2%NaCl溶液、1.0%蔗糖溶液和100%甘油溶液中的存活时间。台盼蓝染色法鉴别华支睾吸虫虫卵的存活情况。2.脱氯水中华支睾吸虫虫卵在不同温度下的存活时间收集具有良好活性的华支睾吸虫虫卵,保存于脱氯水中,观察华支睾吸虫虫卵在0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃和35℃条件下的存活时间。台盼蓝染色法鉴别华支睾吸虫虫卵的存活情况。3.适宜第一中间宿主的选择3.1第一中间宿主易感性评价在25℃条件下,按螺卵比1:10、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90和1:100分别感染纹沼螺、长角涵螺、湖北钉螺、环棱螺、萝卜螺、藳杆双脐螺和光滑双脐螺,每组螺100只,感染30d后敲碎螺壳,显微镜下检查螺的感染情况。3.2纹沼螺的最适感染温度按螺卵比1:60,于20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃、32℃、34℃和36℃条件下感染纹沼螺,每组螺100只,感染30d后敲碎螺壳,显微镜下检查螺的感染情况。4.适宜第二中间宿主的选择4.1第二中间宿主易感性评价在25℃条件下,按照100条尾蚴/鱼,分别感染麦穗鱼、鳑鲏鱼、餐条鱼、葛氏鲈塘鲤和斑马鱼各20条,感染30d后将被感染的鱼全部处死,取其脊背处肌肉压片镜检有无囊蚴。4.2麦穗鱼的最适感染温度按照50条尾蚴/鱼,每组10条鱼,在20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃和35℃条件下感染麦穗鱼,感染30d后将被感染的鱼全部处死,取其脊背处肌肉压片镜检有无囊蚴。5.适合实验室保虫的终宿主的选择每只实验鼠用灌胃针经口灌胃50±1个囊蚴,分别感染Balb/c小鼠30只、CD1小鼠30只、C57bl/6小鼠30只、Wistar大鼠10只和SD大鼠10只,实验鼠感染40天后,小鼠直接采用颈椎脱臼法处死,大鼠先用10%的水合氯醛注射液麻醉,待麻醉后再采用颈椎脱臼法处死。剖取肝脏,检查肝胆管内有无华支睾吸虫,并观察华支睾吸虫的发育情况。结果:1.25℃下华支睾吸虫虫卵在不同溶液中的存活时间25℃条件下保存到第5d时,0.9%NaCl溶液、阿氏液、PBS缓冲液、25%甘油、1.2%NaCl溶液、1.0%蔗糖溶液和100%甘油中的华支睾吸虫虫卵全部死亡,而此时去离子水中虫卵的存活率为96%、脱氯水中虫卵存活率为98%、自来水中虫卵存活率为67%,去离子水组和脱氯水组的差异无统计学意义(P>0.01),但是去离子水组和脱氯水组与其他各组的差异均有统计学意义(卡方检验P<0.01)。保存到第15d时,仅有去离子水组和脱氯水组中还有虫卵存活。保存到第30d时,去离子水组和脱氯水组虫卵存活率分别为16%和46%,两组间的差异均有统计学意义(卡方检验P<0.01)。华支睾吸虫虫卵在脱氯水中保存至第35d时虫卵存活率为22%。由此可见,脱氯水是最适合保存华支睾吸虫虫卵的液体。2.脱氯水中华支睾吸虫虫卵在不同温度下的存活时间0℃组在保存5d,虫卵存活率仅为32%;保存10d虫卵存活率下降为0。5℃组在保存40d,仍然有90%的虫卵存活率;保存60d,虫卵存活率在80%左右。10℃组、15℃组和20℃组保存40d的虫卵存活率分别为22%、18%和12%;5℃条件下保存在脱氯水中的华支睾吸虫虫卵在第60d时虫卵存活率依然在80%以上。由此可见,华支睾吸虫虫卵最适宜的保存温度为5℃。3.适宜第一中间宿主的选择3.1第一中间宿主易感性评价在采集到的七种淡水螺中,只有纹沼螺和长角涵螺成功感染华支睾吸虫,可以选作建立华支睾吸虫生活史循环的第一中间宿主。在感染纹沼螺的10个实验组中,1:60组和1:90组的感染率最高,均为22%。纹沼螺1:50组、1:60组、1:70组、1:80组、1:90组和1:100组之间的感染率差异没有统计学意义(P>0.01),但是1:50组、1:60组与1:70组、1:80组、1:90组以及1:100组之间的死亡率差异有统计学意义(卡方检验P<0.01),但是从1:70组开始,纹沼螺死亡率随着感染量的增大而升高。长角涵螺的最高感染率在18.5%左右,但是从1:40组开始,长角涵螺随着感染量的增加而大量死亡。3.2纹沼螺的最适感染温度按照螺卵比1:60感染纹沼螺,当温度从20℃升至28℃时,纹沼螺的感染率逐渐上升,此时感染率最高可达22.00%;但是当温度继续升高至36℃时,纹沼螺感染率逐渐下降至6.00%。统计学分析表明,24℃、26℃和28℃感染组之间的差异无统计学意义(P>0.01),但是24℃、26℃和28℃感染组与其他各组之间的差异有统计学意义(卡方检验P<0.01)。4.适宜第二中间宿主的选择4.1第二中间宿主易感性评价感染的20条麦穗鱼全部为阳性,阳性率为100.00%;20条鳑鲏鱼中有4条为阳性鱼,阳性率为20.00%;20条葛氏鲈塘鲤中有7条阳性鱼,阳性率为35.00%;20条餐条鱼中有12条阳性鱼,阳性率为60.00%;20条斑马鱼全部为阴性。麦穗鱼的感染率远远高于其他4种淡水鱼,统计学分析表明,麦穗鱼与其他4种淡水鱼之间的感染率差异有统计学意义(卡方检验P<0.01)。4.2麦穗鱼的最适感染温度当温度从20℃升至27℃时,麦穗鱼的感染度和囊蚴获得率逐渐增加;当温度为27℃时,每条麦穗鱼体内平均可收集到40.33±4.22个囊蚴。但是,温度继续升至35℃时,麦穗鱼的感染度和囊蚴获得率逐渐下降,当感染温度为35℃时,平均每条麦穗鱼体内仅可收集到5.68±3.31个囊蚴。经统计学分析,27℃组和28℃组之间的差异均无统计学意义(P>0.01),但是27℃组和28℃与其他各组之间的差异均有统计学意义(卡方检验P<0.01)。5.适合实验室保虫的终宿主的选择本研究所采用的五种品系的实验鼠中,SD大鼠、Wistar大鼠和Balb/c小鼠成功感染华支睾吸虫。SD大鼠感染组和Wistar大鼠感染组的阳性率和成虫获得率(检获华支睾吸虫成虫在检获华支睾吸虫总数中所占的比例)均为100.00%,并且检获率(检获华支睾吸虫数与用于感染的囊蚴数之比)分别为50.80%和49.80%。Balb/c小鼠感染组的阳性率为46.67%,共检获96条华支睾吸虫,其中成虫10条,成虫获得率和检获率分别为10.42%和19.20%。SD大鼠感染组和Wistar大鼠感染组之间的差异没有统计学意义(P>0.01),但是SD大鼠感染组和Wistar大鼠感染组与Balb/c小鼠感染组之间的差异有统计学意义(卡方检验P<0.01)。第二部分左旋吡喹酮对华支睾吸虫杀灭效果的研究目的:1.研究左旋吡喹酮对不同发育阶段的华支睾吸虫的杀灭效果,以确定该药物抗华支睾吸虫的量效关系,从而为该药物的临床应用提供科学依据。2.对比左旋吡喹酮、右旋吡喹酮和消旋吡喹酮对5周龄华支睾吸虫成虫的杀灭效果,以确定左旋吡喹酮的杀虫效果,从而为左旋吡喹酮代替目前市售的消旋吡喹酮提供科学依据。方法:1.实验动物建模用灌胃针经口灌胃210只SD大鼠,每只大鼠灌50±1个囊蚴,将所有感染后的大鼠随机分为7只/笼,饲养于具有12h光照循环及恒温控制的实验动物房(SPF级),正常饮食饮水。2.实验动物给药本研究采用单次灌胃给药法,实验组按每只大鼠体重采用0.1mL/10g经口灌胃法给药。对照组按每只大鼠体重采用0.1mL/10g经口灌胃法给2.5%EL。结果:左旋吡喹酮对大鼠体内不同周龄的华支睾吸虫均具有很强的杀灭效果。其中37.5mg/kg左旋吡喹酮对1周龄的华支睾吸虫幼虫的减虫率92.30%;75mg/kg左旋吡喹酮对2周龄的华支睾吸虫幼虫的减虫率95.00%;75mg/kg左旋吡喹酮对3周龄的华支睾吸虫成虫的减虫率83.87%;75mg/kg左旋吡喹酮对4周龄的华支睾吸虫成虫的减虫率74.52%,但是将药物浓度增加至150mg/kg时,减虫率97.52%;150mg/kg左旋吡喹酮对5周龄的华支睾吸虫成虫的减虫率93.17%,即使剂量降低至75mg/kg仍有58.39%的减虫率。