最近几年,随着生物科技的快速发展,重组蛋白技术也得到了成熟的发展。在蛋白质结构组学及蛋白质的功能和相互作用的研究中,常常需要纯度高,折叠正确的蛋白质,所以纯化出浓度较高的目标蛋白一直是科学家们致力于研究的课题。融合标签技术是新发展起来的一种基因重组技术,主要是在目的蛋白基因序列的N末端或者C末端插入某种融合标签的编码基因序列,构建融合的基因组序列,然后将融合的基因组序列转化到适宜的宿主菌体内,表达带有融合标签的融合蛋白。融合标签是一段对特异的生物基团或者化学基团具有高度亲和力的氨基酸序列。主要有两种类型,一类是小分子量的氨基酸序列,可以和固相介质相互结合,比如His标签,FLAG标签;一类是蛋白标签,可以和小分子配基相互结合,比如GST标签,FMN标签。在实验中发现,融合标签具有提高蛋白产量,增加蛋白溶解度,促进蛋白分子折叠等优点,所以带有融合标签的融合蛋白会相应的产量增加,溶解度增加,蛋白分子易于折叠。最近研究发现有一类蛋白标签在和目标蛋白组成融合蛋白时,融合蛋白会带上颜色,从而使得无颜色的目标蛋白可以变得有颜色,在后续纯化过程中目标蛋白很容易被跟踪和检测。透明颤菌血红蛋白（VHb）是一种15.7KDa的小分子量蛋白,溶解度极高,不论是在原核生物中还是在酵母中进行表达,都能增加细胞的生长速度。碱性果胶裂解酶（CD）是一个分子量大概在22KD,具有碱性果胶裂解酶活性的无色蛋白,在对CD性质进行研究时,常常因为其无色而很难将其表达纯化,得到的蛋白含量很低。为了克服这一难题,我们将VHb作为一种融合蛋白标签和CD进行融合组成融合蛋白,这样融合蛋白将会带上红色,使得无色的CD带上颜色,在后续的纯化过程中会非常容易跟踪和检测。由于VHb的分子量小,溶解度极高,对于提高CD的溶解度和蛋白产量将会有很大的帮助。将VHb和CD进行融合时,我们首先设计vgb基因,在其下游加一段Gly的linker和凝血酶（Thrombin）切割位点,进行PCR扩增,目的基因经酶切等步骤连接到带有厌氧启动子的p UC19载体上。同时我们设计CD基因的引物,在其下游加His标签,将其扩增产物连接到上一步所得到的载体上,最终得到p UC19+promoter+vgb+（Gly）₅+Thrombin+CD的重组质粒。将得到的p UC19+promoter+vgb+（Gly）₅+Thrombin+CD的重组质粒转化到E.coli BL21（DE3）中进行表达纯化。在重组质粒中厌氧启动子可以启动整个融合蛋白的表达,在融合蛋白表达过程中先将表达体系在37℃空气震荡浴中培养10h左右,使得菌体大量扩增,在20℃,100rpm低温厌氧诱导蛋白表达30h左右,使得融合蛋白大量表达。在这个过程中不需要测量OD值,也不需要用IPTG诱导。用大容量冷冻离心机4000rpm,离心40min收集菌体,用于下游的实验。同时收集VHb、CD菌体用于下游的对照实验。在纯化融合蛋白的过程中会发现融合蛋白破碎后得到的上清液为红色,在洗脱目的蛋白时,很容易跟踪和检测到目的蛋白的位置。在得到纯度较高的融合蛋白后,分别做融合蛋白的活性检测、紫外光谱、荧光光谱以及圆二色谱等性质检测分析,并分别和单独的VHb、CD做比较。研究发现在4L的培养体系下,融合蛋白中CD的表达量达到了60mg左右,相比于在4L的培养体系中,CD的表达量为30mg-40mg来说,蛋白表达量提升了50%以上。在融合蛋白中VHb、CD分别有活性,但是活性相比于单独的VHb、CD来说分别降低了10%。通过荧光分析,融合蛋白表现出与CD相似的荧光性质,说明可视化标签VHb对融合蛋白中CD的结构并没有太大的影响,但融合蛋白的荧光吸收与单独的CD相比仍存在一定的差异,可能是由于VHb的加入改变CD表面某些氨基酸集团的暴露程度。VHb是典型的α螺旋结构,在209nm和221nm出现两个负峰,CD是典型的β折叠和α螺旋混合结构,CD在213nm处有个负峰。而融合蛋白表现的圆二色谱性质介于两者之间更趋向于α螺旋,这说明融合蛋白的结构并不是简单的两个蛋白的叠加。