猪传染性胸膜肺炎(Porcine contagious pleuropneumonia,PCP)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起猪的一种高度接触性呼吸道传染病,给世界养猪业造成了巨大经济损失。胸膜肺炎放线杆菌的感染机制复杂,其潜在毒力因子及其致病机理有待充分揭示。TolC蛋白是一种广泛存在于革兰氏阴性菌中的外膜通道蛋白,在多种病原菌中被鉴定为重要的毒力因子。解析胸膜肺炎放线杆菌的TolC同源蛋白在该菌致病过程中发挥的功能及作用机制,对于猪传染性胸膜肺炎的综合防控具有重要的理论指导意义。本研究以临床分离株SC1516为研究材料,采用同源重组技术分别构建了tolC1、tolC2基因突变株,通过比较分析亲本株和突变株毒力相关的生物学特性差异,鉴定了TolC1和TolC2蛋白的毒力相关性。然后利用分子生物学方法从介导分泌毒力蛋白和生物被膜形成两方面分别揭示TolC1和TolC2蛋白在APP定植、感染建立和致病过程中的功能及作用机制。具体工作如下:1.胸膜肺炎放线杆菌tolC1和tolC2基因突变株的构建经同源比对发现,在APP所有血清型的全基因组中均存在两个tolC同源基因,被分别命名为tolC1和tolC2。为了解析APP TolC1和TolC2蛋白的毒力相关性和致病机制,本研究采用同源重组技术分别构建了tolC1和tolC2基因突变株。本研究首先以tolC1基因内部的部分序列与氯霉素抗性基因融合后,克隆至pMD19-T载体,得到重组自杀质粒pCLT。经电转化,pCLT成功整合至亲本株APP SC1516菌株的基因组中。经抗性筛选得到tolC1插入失活突变菌株,命名为tolC1::cat。为了构建tolC2缺失株,本研究首先从将tolC2基因的左右同源臂融合后克隆至pEMOC2,得到重组自杀质粒pEMOC2-ΔtolC2。采用接合转移,pEMOC2-ΔtolC2成功整合至SC1516的基因组中。经氯霉素、蔗糖的正负双向筛选和PCR鉴定,成功筛选得到无抗性标记的tolC2缺失株,命名为ΔtolC2。此外,本研究分别克隆tolC1、tolC2基因的启动子及其完整编码序列连接至穿梭载体pLS88,得到的重组表达载体pLStolC1和pLStolC2分别电转化tolC1、tolC2突变株,获得相应的互补菌株tolC1::cat tolC1~+和ΔtolC2/tolC2。利用TolC1和TolC2蛋白的多克隆抗体进行免疫印迹检测,结果显示tolC1(或tolC2)突变株不能表达TolC1(或TolC2)蛋白,而互补株恢复了这种蛋白的表达能力,证实了重组菌株构建成功。本研究构建的tolC1、tolC2基因突变菌株及其互补菌株为后续TolC1、TolC2蛋白的功能及其致病机制研究提供了生物材料。2.胸膜肺炎放线杆菌tolC1和tolC2基因突变株的生物学特性鉴定为进行TolC1和TolC2蛋白的功能鉴定,本研究分别对tolC1、tolC2基因突变株与亲本株的生物学特性进行了比较分析。生长试验结果显示,tolC1缺失株在对数生长阶段迟缓于亲本株,但达稳定期后无明显差异;菌体形态鉴定发现,透射电镜下,tolC1缺失株细胞内部多有空泡状的低密度区域,细胞表面多水泡状突起,与亲本株差异显著;在溶血试验中,亲本株表现为α溶血,而tolC1突变株完全丧失溶血活性;生物被膜试验显示,tolC1突变株的生物被膜形成能力显著低于亲本株;在药敏试验中,tolC1突变株的浮游菌和生物被膜菌均表现为对多种药物的敏感性显著高于亲本株。在以上这些试验中,tolC2缺失株与亲本株未表现出显著差异。进一步的环境胁迫试验结果显示,在氧化应激、热应激和酸性刺激条件下,tolC1和tolC2突变株的存活率均显著低于亲本株;tolC1突变株对高渗透压的敏感性也显著强于亲本株,tolC2缺失株无差异;在血清杀菌试验中,tolC1突变株与亲本株的存活率无显著差异,而tolC2缺失株对血清杀菌的敏感性显著增加。小鼠腹腔感染试验中,在相同攻毒剂量条件下,tolC1和tolC2突变株的攻毒死亡率分别为20%和40%,显著低于亲本株(90%)。经滴鼻感染后,小鼠肺泡灌洗液中tolC2缺失株的数量显著高于亲本株;tolC1和tolC2突变株在小鼠肺脏中的载菌量均显著降低亲本株。肺脏组织病理切片显示,tolC1和tolC2突变株导致的病理变化比亲本株显著轻微。以上研究结果表明,TolC1和TolC2蛋白参与胸膜肺炎放线杆菌多项生物学功能的发挥,具有显著的毒力相关性。3.胸膜肺炎放线杆菌TolC同源蛋白对ApxII和ApxIV-S毒素的胞外分泌作用研究I型分泌系统是存在于革兰氏阴性菌中的一种简单而高效的蛋白跨膜转运系统,负责多种毒力相关胞外蛋白的分泌。TolC作为外膜通道蛋白,是革兰氏阴性菌I型分泌系统的核心组分蛋白。为了探索APP中TolC1和TolC2对该菌毒力相关蛋白的潜在分泌功能,本研究分别对tolC1、tolC2基因突变株与亲本株的分泌蛋白组成进行了差异性比较分析。经双向电泳分析发现,tolC2缺失株分泌蛋白中存在7个表达量显著低于亲本株的蛋白点。经质谱鉴定和生物信息学分析,这些差异蛋白为定位于胞内的6种蛋白,被鉴定为假阳性差异蛋白。另外,经SDS-PAGE分析发现,tolC1突变株的分泌蛋白电泳条带分布与亲本株存在明显差异。对差异条带区域分别进行液相色谱-质谱鉴定及差异性筛选,得到6种可信度较高且只存在于亲本株而不存在于tolC1突变株分泌蛋白中的差异蛋白。结合生物信息学分析结果,鉴定出ApxIIA和ApxIVA-S(短的ApxIVA)两种毒素蛋白为TolC1的潜在分泌底物蛋白。同源比对分析显示,ApxIVA-S约有50%的氨基酸与经典的ApxIV一致,一致区域集中于C端,鉴于I型分泌系统的分泌信号位于C端的特性,可推理得出ApxIVA很可能也是由TolC1介导分泌。apxIVA-S很可能为经典apxIVA在基因组上的不完全拷贝,具有体外表达能力。qRT-PCR结果显示,tolC1突变株中的apxII和apxIV-S基因的mRNA水平与亲本株无显著差异。分别利用ApxIIA和ApxIVA-S的多克隆抗体进行免疫印迹检测显示,在tolC1突变株分泌蛋白中不能检测到ApxIIA和ApxIVA-S蛋白,证实了TolC1蛋白对ApxIIA和ApxIVA-S的分泌作用。总的说来,本研究首次在APP菌株体外培养条件下鉴定得到ApxIVA-S蛋白,并揭示了TolC1对ApxIIA和ApxIVA-S毒素蛋白的分泌作用,而TolC2不参与胞外蛋白的分泌过程。4.胸膜肺炎放线杆菌TolC同源蛋白介导生物被膜形成的作用机制研究生物被膜的形成对于病原菌在宿主体内定植和建立感染具有重要意义。前期生物被膜形成试验结果显示,tolC1突变株的生物被膜含量显著低于亲本株。本部分研究旨在进一步阐释TolC1蛋白介导生物被膜形成的作用机制。测定比较tolC1突变株和亲本株生物被膜的形成周期发现,生物被膜含量的最大值均出现在6h和12h,而之后生物被膜含量均逐渐降低;两组细菌的生物被膜周期曲线的变化趋势一致,说明tolC1突变株与亲本株生物被膜的成熟速率无差异。表面粘附试验和激光共聚焦结果均显示,在生物被膜形成早期,tolC1突变株的粘附细菌数量显著低于亲本株。疏水性试验和自凝集试验显示,tolC1突变株菌体的表面疏水性和自凝集活性显著降低。胞外多糖PGA是构成APP生物被膜基质的骨架和主要组分,在细菌的粘附过程中发挥重要作用。DspB酶处理试验显示,tolC1突变株早期生物被膜基质中的PGA所占比例显著低于亲本株;同时qRT-PCR结果显示,tolC1突变株早期生物被膜菌的pgaA基因转录下调。表明tolC1突变株菌体表面疏水性和自凝集活性的降低及PGA的合成不足可能是其粘附能力显著下降的重要原因。此外,蛋白酶K和DNase I处理试验还发现,tolC1突变株生物被膜基质中的胞外蛋白和胞外DNA的比例也低于亲本株。Transwell试验发现,亲本株培养液中含有某种(些)介导生物被膜形成的必要因子,对于tolC1突变株生物被膜形成缺陷具有部分拯救作用。以上研究结果表明,TolC1蛋白参与维持细菌正常的表面疏水性和自凝集活性,调控生物被膜形成早期细菌pgaA基因的转录和PGA的合成,从而介导细菌的表面粘附能力,在生物被膜形成早期的粘附过程中发挥重要作用。此外,TolC1蛋白很可能还通过参与分泌某种(些)生物被膜形成必要因子介导APP生物被膜形成。总之,本研究揭示了TolC1蛋白介导APP生物被膜形成的作用机制,为以TolC1为潜在抗生物被膜的靶标蛋白的研究提供理论基础。