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研究背景心脑血管疾病是目前世界范围内严重影响人类健康、大量消耗社会医疗资源的主要疾病之一,在中国,每年因心脑血管疾病死亡的人数大约有300万人。动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是心脑血管疾病发病的主要原因之一,其中血浆低密度脂蛋白胆固醇(Low Density Lipoprotein Chesterol,LDL-C)浓度与AS发生的风险呈正相关。低密度脂蛋白受体(LDL receptor,LDLR)与体内LDL的代谢密切相关。其中LDLR介导的经典的内吞途径是体内清除LDL的主要方式。目前在临床上广泛应用的他汀类药物能够通过调节LDLR的表达,降低血液中LDL-C的水平,从而有效预防心脑血管疾病的发生,但在家族性高胆固醇血症(familial hypercholesterolemia,FH)患者中,这些药物无法达到降低LDL-C和心血管疾病发生风险的目的,并且约有30%的患者对他汀类药物不耐受。因此,探索和发现新的治疗靶点和药物依然具有重要的现实意义。氨基酸代谢稳态对调节细胞的生物学功能起着至关重要的作用。有研究表明,氨基酸饥饿(Amino Acid Starvation,AAS)能通过作用于mTORC1信号通路来诱导细胞自噬,但AAS是否对细胞摄取LDL的功能有调节作用目前尚无文献报道。本课题中我们将研究AAS对细胞LDL内吞作用的影响及其可能的机制。研究目的1.研究AAS对LDL摄取功能的影响2.研究AAS对LDLR的表达和空间分布的影响3.研究AAS调节LDL摄取作用的可能机制研究方法1.在小鼠胚胎成纤维细胞(NIH-3T3)和人肝癌细胞(HepG2)中,研究AAS对细胞摄取LDL的影响,随后在氨基酸缺乏的培养基中补全缺失的氨基酸成分对实验结果进行反向验证。用网格蛋白的抑制剂(Pitstop2和Dynasore)处理细胞,激光共聚焦显微镜检测细胞摄取Dil-LDL的变化。观察低糖、低血清对LDL摄取的影响。选取8周龄经过基因型鉴定的WT小鼠和LDLR-/-小鼠分别提取肝脏原代细胞,体外培养,荧光显微镜检测AAS对Dil-LDL摄取的影响。2.用放线菌素D(Actinomycin D)和放线菌酮(Cycloheximide)处理细胞,抑制mRNA和蛋白的合成,激光共聚焦显微镜检测细胞对Dil-LDL的摄取。分别用流式细胞术、western blot的方法检测AAS刺激对细胞内LDLR、LC3B和p62表达的影响。用自噬的诱导剂雷帕霉素(Rapamycin)处理细胞,免疫荧光法检测LC3和Dil-LDL摄取的变化。用ATG5的siRNA抑制自噬反应,检测AAS对Dil-LDL摄取的影响。3.合成pEGFP-LDLR的质粒,转染细胞,采用荧光漂白后恢复(fluorescencerecovery after photobleaching,FRAP)方法观察AAS对LDLR分子的运动速率的影响。4.采用PI3K的抑制剂wortmannin、AKT激酶抑制剂AKT1/2、VPS34的抑制剂VPS34-IN1、SAR405处理细胞,激光共聚焦显微镜检测细胞摄取Dil-LDL的变化。将AAS对细胞摄取Dil-LDL的影响与他汀(Pravastatin)的作用相比较。研究结果1.在NIH-3T3和HepG2细胞中,给予不同时间的氨基酸饥饿,激光共聚焦显微镜结果显示,细胞时间依赖性的增加了 Dil-LDL的摄取,补全氨基酸后这种现象被逆转,而低糖和低血清对LDL的摄取无影响。网格蛋白抑制剂组抑制了 AAS增加LDL摄取的作用,在LDLR-/-的小鼠中,AAS对LDL摄取的作用无显著影响。2.Actinomycin D和Cycloheximide处理对细胞摄取LDL的作用无显著影响。Western Blot和PCR结果显示,AAS刺激对LDLR表达量无明显影响。流式细胞和免疫荧光法显示AAS后膜表面LDLR的表达增加。实时定量PCR和Western Blot结果显示,短暂的AAS没有影响p62和LC3B的表达。自噬的诱导剂Rapamycin处理对LDL的摄取无显著影响。同时,转染ATG5 siRNA抑制自噬反应,共聚焦显微镜结果显示ATG5 siRNA对Dil-LDL的摄取作用没有显著影响。3.FRAP实验结果显示,AAS缩短了被漂白区域荧光恢复所需时间,提示AAS增加了LDLR的运动速度,进而增加了对LDL的转运。4.激光共聚焦显微镜结果显示,AKT1/2 inhibitor对AAS的作用无影响,SAR405、VPS34-IN1和wortmannin显著降低了 AAS对细胞摄取Dil-LDL的影响。短时间(4h)内,AAS和Pravastatin均增加了 Dil-LDL的摄取,AAS促Dil-LDL摄取的作用与他汀相似。实验结论1.AAS诱导细胞增加了 LDL的摄取2.AAS诱导细胞增加LDL摄取的作用是网格蛋白途径和LDLR依赖的3.AAS增加了 LDLR在细胞膜表面的分布而不是影响其表达量4.AAS增加LDL摄取的作用可能是VPS34部分依赖的展望进一步研究AAS影响LDLR空间分布的信号传导通路可能为开发不依赖于调节LDLR基因表达的降脂方法提供新思路。