前列腺癌是西方发达国家男性最常见的恶性肿瘤,占男性癌症相关死亡率9%,是男性癌症患者的第二大死因。传统的药物和/或手术去势治疗仍是前列腺癌和转移癌的标准疗法。然而,前列腺癌患者雄激素阻断治疗(ADT)失败与最终进展成雄激素非依赖性前列腺癌阶段,目前已成为泌尿外科临床治疗难点问题,同时非雄激素依赖的前列腺癌的发生、发展的分子机制也是国际上研究的热点领域。雄激素受体(AR)在前列腺癌疾病的发生发展中起重要作用,新近的前列腺癌干细胞理论认为:前列腺肿瘤组织中存在一种极少量具有无限增殖、自我更新和多向分化潜能的癌干细胞。在ADT治疗后,干细胞群明显增多,提示前列腺癌干细胞可能是前列腺癌复发和非激素依赖性前列腺癌发生、发展的重要机制之一。近年来,肿瘤表观遗传学调节是研究前列腺癌发生、发展机制的又一热点领域,通过调节肿瘤相关基因转录调控区域CG序列的DNA甲基化来影响基因的表达。有研究表明,AR基因启动子区域甲基化可以沉默AR基因的表达。我们的前期研究发现,前列腺癌干细胞系不表达或弱表达AR,且其启动子区域存在大量甲基化修饰的位点,这提示:前列腺癌干细胞表遗传学的调节可影响AR的表达水平和前列腺癌的进展。因此,本研究试图从前列癌细胞系中分离出前列腺癌干细胞并研究其生物学特性;探索AR在前列腺癌干细胞中的作用及其表遗传学的调节过程;阐明AR表遗传学的调节在维持前列腺癌干细胞特性及促进前列腺癌进展的分子机制,为靶向前列腺癌干细胞治疗提供科学依据。方法:本课题分三个部分进行试验研究:1、人前列腺癌LNCaP细胞系肿瘤干/祖细胞的分离与鉴定:①应用流式细胞分选仪和免疫磁珠分选系统,以CD133为干细胞表面分子标志,从人前列腺癌LNCaP细胞系中分离肿瘤干/祖(LNCaP S/P)细胞亚群;②应用Q-PCR和免疫荧光染色定量分析干细胞亚群和非干细胞亚群分子表达谱特征;③应用Matrigel克隆球形成实验检测干细胞的自我更新能力;软琼脂克隆形成实验检测干细胞体外成瘤能力;及建立干细胞和非干细胞SCID小鼠体内前列腺原位模型,证实上述两种细胞体内成瘤能力的差异。证实筛选出具有自我更新、多向分化和增殖潜能的肿瘤干细胞群。2、AR对人前列腺癌LNCaP细胞系干/祖细胞的作用实验研究:①应用Q-PCR和Westerm-blot检测AR在人前列腺癌LNCaP干/祖细胞与非干细胞亚群中内源性mRNA和蛋白的表达水平;②建立慢病毒系统,过表达LNCaP干细胞AR,通过MTT、Soft-agar和裸鼠体内实验,检测过表达AR对前列腺癌干细胞体内外增殖、分化和成瘤能力的影响。3、DNA甲基化抑制剂(5-Aza)对前列腺癌干/祖细胞系中AR的表遗传学调节实验研究:①应用甲基化特异性PCR技术,分析LNCaP干/祖细胞AR启动子的甲基化状态,探讨LNCaP干/祖细胞AR的表遗传调节机制;②同时应用免疫荧光染色检测不同剂量的5-Aza对LNCaP S/P细胞的CK5、CK8及AR等干细胞及分化相关基因表达的调节;③应用Matrigel克隆球形成实验及软琼脂克隆形成实验检测5-Aza对前列腺癌干细胞自我更新和体外成瘤能力的影响。结果:1、人前列腺癌LNCaP细胞系肿瘤干/祖细胞的分离与鉴定:①应用免疫磁珠分选仪和流式细胞仪检测LNCaP细胞发现CD133+和Integrina2β1+的表达率分别为0.7%～1.2%;89.2%～93.7%;CD44阴性表达;确定CD133为干细胞筛选标记物;②LNCaP CD133+细胞具有较强的分化、增殖和克隆形成能力,与CD133-组对比LNCaPCD133+细胞克隆球形成数量,差异具有显著性(P<0.01);③LNCaP细胞系中CD133阳性细胞与CD133阴性细胞两组亚群的基因mRNA水平及蛋白表达检测结果显示:CD133阳性表达的细胞中其干细胞标志基因Integrina2β1、CD133、CK5mRNA水平及蛋白表达水平显著高于CD133阴性表达细胞;干细胞分化标志蛋白:CK8、AR、PSA在CD133阳性细胞中呈低表达,在CD133阴性细胞为高表达;④裸鼠体内成瘤实验结果显示,从LNCaP分选的CD133阳性表达细胞在裸鼠体内的成瘤率100%(5/5),CD133阴性表达细胞组成瘤率为60%(3/5),两组小鼠成瘤率经统计学处理差异明显,P<0.05。2、AR对人前列腺癌LNCaP干/祖细胞的作用:Q-PCR和Western-blot结果显示:①LNCaP干/祖细胞中AR表达水平明显降低;②使LNCaP S/P细胞过表达AR后,其干细胞标志物CD133、integrin和基底细胞特征性标记CK5表达明显降低,细胞分化的特异性标志物CK8和AR表达明显增强;③结果显示AR过表达明显抑制LNCaP S/P细胞的增殖能力及克隆球形成的数量;④(裸鼠)体内研究证实,LNCaP S/P细胞过表达AR能明显抑制其在SCID裸鼠体内的成瘤能力。3、DNA甲基化抑制剂(5-Aza)对前列腺癌干/祖细胞系中AR的表遗传学调节实验研究:①5-Aza可明显上调LNCaP S/P细胞AR表达,对LNCaP NS/P细胞的AR无明显作用;②应用不同浓度的5-Aza(IC50为8.5μM)处理LNCaP S/P细胞5天后,AR和CK8表达明显升高,CK5表达水平减低,并呈剂量依赖性;提示5-Aza诱导LNCaP干细胞AR表达上调,是促进癌干细胞分化的关键基因;③克隆球形成实验和Soft-agar结果显示不同浓度的5-Aza抑制LNCaP S/P细胞自我更新和体外成瘤能力,呈剂量依赖性。结论:1、CD133可作为分选LNCaP肿瘤干细胞的表面分子标记,分选出的CD133+干细胞群具有较强的自我更新、多向分化、增殖、克隆形成和实验鼠体内成瘤能力,提示CD133是判定前列腺癌干细胞的重要生物学标记物。2、AR在人前列腺癌LNCaP干细胞亚群中呈低水平表达;AR抑制人前列腺癌LNCaP细胞系干细胞的增殖、自我更新及体内成瘤的能力,并促进前列腺癌干细胞的分化与凋亡。3、AR启动子的DNA去甲基化作用可诱导LNCaP干细胞AR表达升高,促进LNCaP干细胞的分化能力,抑制LNCaP干细胞生长、自我更新和体内成瘤能力。本课题为深入研究AR表遗传学的调节在维持前列腺癌干细胞的生物学特性,非激素依赖性前列腺癌的发生、发展机制以及靶向前列腺癌干细胞分子治疗研究的开展提供了重要的科学依据。