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比率型荧光探针通过引入多个荧光峰来实现比率信号的输出,能减少环境因素的干扰,并消除某些系统误差,从而提高检测的可靠性。尽管目前发展的比率型荧光方法具有良好的靶标检测性能,但是需要对荧光探针进行标记,而且往往受限于有机荧光染料的抗光漂白性能和供体-受体对的数量。随着纳米科学和技术的发展,基于新型荧光纳米材料发展的比率型荧光探针不仅克服了以上缺陷,还具有成本低、生物相容性高、水溶性好、荧光光谱可调、易于功能化修饰等优势,在生化分析领域得到了广泛的应用。其中,“变色龙”DNA-银纳米簇（DNA-AgNC）已成为比率型荧光探针设计的新型材料,这不仅由于它们具有多个荧光发射峰,而且合成简便、价格低廉、设计灵活、无需在探针上进行复杂的荧光标记。宫颈癌的发生和发展与人乳头瘤病毒（HPV）的持续感染有关,通过HPV DNA的检测可用于宫颈癌的筛查。本论文利用“变色龙”DNA-AgNC设计合成了比率型荧光探针,实现了人血清样品中HPV DNA的检测。研究内容包括:1.基于变色龙DNA-银纳米簇的比率型二元探针用于HPV相关DNA的检测我们选择两个DNA-AgNC来构建荧光二元探针实现在血清中HPV-16 DNA的检测,其中一个是具有双激发和双发射荧光的变色龙DNA-AgNC,另一个是没有荧光的DNA-AgNC。荧光二元探针目标DNA杂交后拉近了两个DNA-AgNC的距离,使得变色龙DNA-AgNC的荧光在黄色和红色之间切换,实现了HPV-16 DNA的比率型检测。首先通过简单还原法合成DNA-AgNC,获得的纳米探针显示出AgNC两种典型的黄色和红色发射;在加入HPV-16 DNA后,AgNC的黄色荧光显著降低,而红色荧光增加,样品中HPV-16 DNA的浓度通过570 nm和630 nm处荧光强度的比率来表征。该比率型纳米探针对HPV-16 DNA有良好的选择性,其检测限为2 nM。此外,通过分析人血清中的HPV-16 DNA也证明了该策略的实用性,说明其在未来临床诊断中有潜在的应用前景。2.基于变色龙荧光DNA-银纳米簇和发夹封闭型脱氧核酶辅助的核酸级联放大用于HPV-16 DNA的比率型检测上一个工作实现了HPV-16 DNA的检测,但是其检测灵敏度还有提高的空间。为此,本章通过引入发夹封闭的脱氧核酶（DNAzyme）探针结合催化发夹组装（CHA）,开发了一种简单有效的双重信号放大方法。在没有靶标DNA的情况下,发夹封闭的DNAzyme链通过分子内杂交形成发夹结构,可以抑制DNAzyme链的催化活性;然而在靶标存在时,靶标与探针的杂交可以打开发夹并在催化核心中形成活性二级结构,以产生“有活性的”DNAzyme,然后在Mg2+的帮助下自身切割反应;切割的两个DNA片段与靶分离,较短的DNA片段引发下游的CHA反应,使得“变色龙”DNA-AgNC的荧光信号从红色转变为黄色;同时,靶标也被释放并与另一个发夹封闭的DNAzyme链结合,以驱动下一个循环。以这种方式,靶标的再循环扩增导致明显的信号变化,达到5.7 pM的检测限,有望为HPV DNA的高选择性和灵敏度分析提供一个新平台。3.基于变色龙荧光DNA-银纳米簇用于同时比率型检测HPV-16 DNA和HPV-18 DNAHPV-16和HPV-18是引起宫颈癌的最主要的两种病毒类型,约70%的宫颈癌都是由HPV-16和HPV-18引起的。因此,本章利用变色龙DNA-AgNC作为信号源,设计了三条DNA探针,包括P1探针（对应于HPV-18）、P2探针（对应于HPV-16）以及发夹探针HP。首先P1和P2能够与HP杂交形成复合物打开HP的发夹结构,此时DNA-AgNC的荧光为黄色。当两个靶标同时存在时,靶标分别与P1和P2杂交,将P1和P2从HP上竞争下来,此时HP由于分子内部杂交而形成发夹结构,使得DNA-AgNC的荧光从黄色变为红色,从而实现HPV-16和HPV-18的同时检测。该策略也可以用于血清样品中目标物的检测。