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目的 研究证实，95%的尤文肿瘤家族具有特异性t(11;22)(q24;q12)染色体易位，形成的EWS-FLI-1融合蛋白可以识别、结合一段特异基因序列(ACCGGAAGT)并且激活其下游基因表达。本研究通过定向克隆，构建了含有该特异序列和白喉毒素A链(DTA)基因的真核表达载体。转染体外培养的尤文肉瘤细胞后，检测DTA表达及其对细胞的杀伤作用，为肿瘤特异性基因治疗探索新的方法。方法 1、用脂质体法，把含有EWS-FLI-1特异结合基因序列的虫荧光素酶报告质粒(pS2)转染到体外培养的尤文肉瘤细胞系(RD-ES、SK-ES)以及对照细胞系(Hela、NIH3T3)。通过荧光分光光度计检测相对荧光强度，比较虫荧光素酶的表达。2、用定向克隆的方法，把DTA片段在NcoⅠ和XbaⅠ位点替换pS2中的虫荧光素酶基因。构建新表达载体pS2-DTA。双酶切以及测序验证。3、共转染pS2和pS2-DTA，检测相对荧光强度，验证pS2-DTA转染成功，并且对虫荧光素酶合成产生抑制作用。4、转染pS2-DTA后，通过RT-PCR和免疫组化检测DTA的表达、TUNEL法检测细胞凋亡、台盼蓝拒染实验比较细胞存活率、细胞形态学和生物学变化等指标观察其对尤文肉瘤细胞的杀伤作用。结果 1、对重组载体的酶切鉴定和测序结果证实，在pS2-DTA中EWS-FLI-1特异性结合序列(ACCGGAAGT)位于白喉毒素A链基因上游。2、荧光定量检测结果表明：(1)转染pS2后，尤文肉瘤细胞组的相对荧光强度显著高于对照组(p<0.01)；(2)共转染pS2和pS2-DTA后，虫荧光素酶的合成受到抑制。SK-ES细胞组的相对荧光值降低幅度显著高于Hela细胞组(P<0.05)。3、转染pS2-DTA观察细胞生物学变化和DTA表达及对细胞的杀伤作用结果表明：(1)在尤文肉瘤细胞中细胞分裂相少见、存活率低且生长缓慢，对照细胞却很快进入对数生长期；(2)尤文肉瘤细胞中，DTA在mRNA和蛋白水平的表达都显著增加，TUNEL指数也比对照细胞显著增高(P<0.01)。结论 1、我们通过定向克隆的方法，成功地构建了含EWS-FLI-1特异结合序列和白喉毒素A链基因的真核表达载体。2、尤文肉瘤特异性的EWS-FLI-1融合蛋白有强烈的转录活性，可以促进虫荧光素酶基因高表达。3、在共转染实验中，pS2-DTA<WP=7>成功转入培养细胞，并对虫荧光素酶的合成产生抑制作用，在尤文肉瘤中更加明显。4、pS2-DTA在尤文肉瘤细胞中高表达，促进细胞凋亡，产生选择性杀伤作用，抑制尤文肉瘤细胞生长，而在非尤文肉瘤细胞中这种作用显著降低。