1. 研究背景　　物质财富的丰富逐渐改变了人们的生活、饮食习惯。从以往的素食结构为主向高脂肪、高蛋白方向转变，孕育而生的是代谢性疾病的增加[1]。其中以糖尿病为首的代谢疾病，不断地威胁着人类的健康。在我国糖尿病作为基础性疾病其发病率和患病率逐年增高。有研究表明 2000 年我国的糖尿病患者接近二千万左右，随后的八年时间，我国糖尿病人数猛增至九千五百万，直至 2015 年这一人数将达到一亿以上。人们预测在本世纪中叶这一数字将达到一亿五千万[2]。这一疾病的防治成本将大大增加。有学者研究表明，糖尿病最主要的经济负担来源于并发症和相关的疾病，并且直到 2030 年这一卫生成本将不断地增加[3]。糖尿病心肌病是糖尿病的一种心血管并发症之一，因其临床症状隐匿、病程进展缓慢而往往被医患所忽略。糖尿病心肌病是一种排他性疾病，它独立于常见的心血管危险因素，并且以早期舒张功能和中晚期收缩功能障碍为特点[4, 5]。具体的发病机制十分复杂，在其病程的进展中常常伴随着细胞凋亡、氧化应激、内质网应激以及终末代谢物糖基化等。　　腺苷A2B受体是腺苷受体四种亚型之一。4种不同腺苷受体亚型（腺苷A1受体、腺苷A2A受体、腺苷A2B受体亚型、腺苷A3受体亚型）调节心肌收缩、肾上腺素改变、心率、心脏电生理传导、细胞损伤和死亡等。当前糖尿病或高糖环境导致的心肌组织凋亡机制复杂且仍然未明确一致。根据之前研究报道，腺苷 A2B 受体的激活在梗死和非梗死的心肌有抗凋亡的作用。其次高糖环境诱导心肌细胞凋亡已经成为研究者们的共识。因此本课题组推测腺苷A2B受体可能参与糖尿病心肌病发生、进展。　　2. 研究方法　　2.1. 体内-构造糖尿病心肌病大鼠模型　　2.1.1.选择5周龄体重220±20g的SD大鼠喂食高糖高脂饲料8周，小剂量腹腔注射STZ，构造大鼠糖尿病模型。　　2.1.2.大鼠糖尿病模型造模后观察、监测尾静脉血糖及体重变化；大鼠高糖高脂喂养 38 周龄后进行心脏超声检测左室短轴、左室长轴、左室舒张末容积（LVEDV）、左室收缩末容积（LVESV）、二尖瓣左室舒张早期快速充盈峰/二尖瓣舒张晚期充盈峰（E/A）、左室射血分数（LVEF）、左室短轴率（LVFS）、心率（HR）等指标。　　2.1.3.处死喂养38周龄的大鼠，在活体下抽取大鼠血液离心后取上清液以检测总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、心肌钙蛋白I(cTnI)、心肌肌酸激酶同工酶（CK-MB）指标。　　2.1.4.取下心脏组织并用4%多聚甲醛固定以进行HE染色和Masson染色；观察不同干预下心肌组织纤维化的改变。　　2.2.腺苷A2B受体激活对糖尿病心肌病大鼠心肌组织凋亡的影响。　　2.2.1.处死喂养38周龄的大鼠，取心肌活体组织后立即对大体标本进行拍照。其后用锡箔纸包裹并标记放置于临时液氮中，实验操作完毕后标本立即放于-80℃保存。　　2.2.2.取-80℃保存的心肌组织，在冰上解冻后用刀片将组织分割成组织小块并分装储存。用RNA Isoplus裂解约30ug的心肌组织，经过RNA的提取、逆转录形成cDNA、RT-PCR三步，检测腺苷A2B受体、凋亡蛋白Bax、抗凋亡蛋白BCL-2在正常、糖尿病心肌病（DCM）、糖尿病心肌病（DCM）+腺苷A2B受体激动剂（BAY66583）、糖尿病心肌病（DCM）+腺苷A2B受体激动剂（BAY66583）+PI3K/akt受体拮抗剂（LY294002）、糖尿病心肌病（DCM）+腺苷A2B受体拮抗剂（MRS1754）各组中mRNA表达情况。　　2.2.3.同样用冰冻组织标本提蛋白、电泳、转膜、封闭、孵育一抗、二抗到最终蛋白显影以检测五组腺苷 A2B 受体、凋亡蛋白 Bax、Caspase-3、Caspase-9、抗凋亡蛋白BCL-2以及PI3K/akt信号途径分子。　　2.2.4. 4%多聚甲醛固定的心肌组织经过石蜡包埋形成石蜡切片，通过脱蜡水化等步骤后进行TUNEL凋亡显色反应。　　2.3.体外-腺苷A2B受体激活对高糖诱导的H9C2心肌细胞的影响。　　2.3.1.以33.3mmol/L浓度的高糖诱导H9C2细胞48h后，用RNA Isoplus分别提取各组的 RNA，经过逆转录 cDNA、RT-PCR 检测各组腺苷 A2B 受体、Bax、BCL-2 的mRNA的改变。　　2.3.2.以33.3mmol/L浓度的高糖诱导H9C2细胞24h、48h、72h，TUNEL染色法观察细胞凋亡的时间相关性，以确定最佳的凋亡时间。继续用高糖对H9C2细胞进行诱导，同时施加腺苷受体激动剂（BAY606583）、腺苷受体抑制剂（MRS1754）以及信号通路阻断剂（LY294002）以观察各组细胞凋亡的情况。　　2.3.3.在上述TUNEL染色的同时相隔一段时间后用同批细胞、同样的处理时间、方式对高糖诱导的H9C2细胞进行流式细胞学计数，以检测细胞的凋亡率。　　2.3.4.以上述同批次细胞不同干预分组后在高糖的刺激下进行细胞蛋白的收集、经过电泳、转膜、封闭、一二抗孵育、蛋白显影检测腺苷A2B受体、凋亡蛋白Bax、Caspase-3、Caspase-9、抗凋亡蛋白BCL-2以及信号通路P-AKT蛋白的改变。　　2.4.体外CRISPR-Cas9构建A2B受体基因敲除细胞及A2B受体基因敲除在高糖诱导心肌细胞凋亡中的作用。　　2.4.1.网上构建敲除A2B受体基因的gRNA序列，之后生物公司进行合成，并保存于-20℃。Addgen公司购买eSpCas9(1.1)-T2A-Puro质粒后通过热激转入大肠杆菌，通过扩大培养后提取eSpCas9(1.1)-T2A-Puro质粒待用。　　2.4.2. BbsⅠ酶切质粒后通过磷酸化酶PNK和T4连接酶将gRNA序列连接入质粒形成 eSpCas9(1.1)-T2A-Puro-A2BgRNA 重组质粒，测序并鉴定重组质粒以连接入A2BgRNA。　　2.4.3.用重组质粒转染H9C2细胞后，嘌呤霉素筛选转染入重组质粒的H9C2细胞。此时的Pool细胞进行扩大培养并冻存保种。　　2.4.4. Pool细胞用T7E1进行酶切以确定是否发生基因的编辑，若出现酶切条带说明H9C2细胞发生编辑。　　2.4.5.对发生编辑的Pool细胞通过倍比稀释法进行单克隆的筛选。　　2.4.6.疑似编辑的单克隆细胞于24孔板种植满后再次用T7E1进行酶切，此时若出现酶切条带，则说明该疑似编辑的单克隆细胞为杂合子。相反未出现酶切条带则考虑可能为纯合子。　　2.4.7.上述未酶切条带的细胞和WT细胞进行杂交，提取DNA后进行第三次酶切。此时出现条带则高度疑似为基因编辑的纯合子细胞。　　2.4.8.上述疑似纯合子细胞进行WB蛋白鉴定，条带相对于WT消失，则明确为腺苷A2B基因敲除细胞，若蛋白条带未消失，进行基因组测序寻找原因。　　2.4.9.通过Control、HG、HG+BAY606583、HG+A2B KO、HG+ A2B KO+BAY606583分组，TUNEL法检测细胞凋亡。　　2.4.10.通过Control、HG、HG+BAY606583、HG+A2B KO、HG+ A2B KO+BAY606583分组，WB检测凋亡蛋白Bax、Caspase-3、Caspase-9、抗凋亡蛋白BCL-2的改变。　　3.研究结果　　3.1. 糖尿病心肌病大鼠模型造模数据　　3.1.1. 38周龄的SD大鼠，糖尿病心肌病组大鼠的体重低于普食组（459.7±21.6 vs 587.7±21.8g P＜0.05）。其余DCM+BAY606583、DCM+ BAY606583+ LY294002、DCM+MRS1754与DCM组体重无差异（P＞0.05）　　3.1.2. 糖尿病SD大鼠造模后，18-38周每4周监测一次血糖，血糖变化各组之间无明显差异（P＞0.05），但与16.7mmol/l比较各组血糖高于这个平均值（P＜0.01）。　　3.1.3. 38周龄的SD大鼠，糖尿病组的TC（5.83±1.22 vs 1.37±0.11）、TG（3.94±0.41 vs 0.94±0.16）、LDL-C（3.04±0.37 vs 0.29±0.10）、HDL-C（0.76±0.24 vs 1.37±0.18）、cTnI （0.31±0.03 vs0.01±0.006）、CK-MB（2.00±0.31 vs 0.38±0.07），均显著高于空白对照组。DCM+BAY606583组cTnI（0.14±0.02 vs 0.31±0.03）、CK-MB（1.09±0.22±2.00±0.31）均低于DCM组。　　3.1.4. 38周龄的SD大鼠，糖尿病组的心肌纤维化显著高于空白对照组（P＜0.01）， DCM+BAY606583、DCM+ BAY606583+ LY294002、DCM+MRS1754与DCM组纤维化程度无差异（P＞0.05）。　　3.1.5. 38周龄的SD大鼠，糖尿病组的LVEDV（0.62±0.11 vs 0.91±0.14）、E /A （0.69±0.03 vs 1.8±0.41）、LVEF（70.12±1.57 vs 86.41±2.24）、LVFS（43.28±0.71 vs 54.17±0.94）、HR（327.0±29.0 vs 400.0±37.0）、均低于空白对照组（P＜0.05）；LVESV （0.34±0.04 vs 0.24±0.01）高于空白对照组（P＜0.05）。DCM+BAY606583组LVEDV （0.84±0.07 vs 0.62±0.11）、E /A（1.4±0.33 vs 0.69±0.03）、HR（357 .0±47.0 vs 327.0±29.0）均高于DCM组。　　3.2.腺苷A2B受体激活对糖尿病心肌病大鼠心肌组织凋亡影响的结果。　　3.2.1. DCM组比对照组的A2B mRNA水平明显地降低（P﹤0.01）；DCM+BAY606583组相对于DCM组A2B mRNA明显地升高（P﹤0.01）；DCM+BAY606583 +LY294002组A2B mRNA水平低于 DCM+BAY606583组（P﹤0.05）。DCM+ MRS1754其A2B mRNA水平明显较DCM+BAY606583组低（P﹤0.01）。DCM组凋亡蛋白Bax mRNA水平明显的高于空白对照组和DCM+BAY606583组（P﹤0.01）；DCM+BAY606583组Bax mRNA略为低于DCM+BAY606583+LY294002组（P﹤0.05）。DCM组凋亡蛋白Bcl-2 mRNA水平明显的低于空白对照组和DCM+BAY606583组（P﹤0.01）。后者DCM+BAY606583组Bcl-2 mRNA高于DCM+BAY606583+LY294002组（P﹤0.05）。　　3.2.2TUNEL法测量心肌细胞凋亡，发现DCM组细胞凋亡率明显地高于DCM+BAY606583 组和空白对照组（ P﹤0.01 ），并低于 DCM+MRS1754 组。DCM+BAY606583组心肌凋亡率低于DCM+BAY606583+LY294002组（P﹤0.05）。　　3.2.3.凋亡蛋白Bax、Caspase-3、Caspase-9， DCM组均高于空白对照组（P﹤0.01）， DCM+BAY606583组表达量较DCM组低（P﹤0.01）。BCL-2抗凋亡蛋白则相反。　　3.3.体外-腺苷A2B受体激活对高糖诱导的H9C2心肌细胞影响的结果。　　3.3.1. TUNEL法显示高糖诱导的H9C2细胞凋亡具有时间正相关性。　　3.3.2.流式细胞检测高糖诱导的心肌细胞凋亡其凋亡率HG组高于Control组（P﹤0.05）；DCM+BAY606583组心肌凋亡率低于DCM组（P﹤0.01）和DCM+BAY606583+ LY294002组（P﹤0.05）。　　3.3.3高糖诱导的H9C2心肌细胞，A2B受体蛋白低于对照组和甘露醇组（P﹤0.05）；磷酸化Akt（P-Akt）在高糖的处理下表达低于对照组和甘露醇组，并且于时间有一定的负相关性（P﹤0.05）。对照组的P-Akt高于高糖组（P﹤0.01）；并且在腺苷A2B受体激动剂 BAY606583 激活腺苷后 P-Akt 高于 Akt 信号阻断组（P﹤0.05）；高糖处理后LY294002或MRS1754，P-Akt均明显低于对照组（P﹤0.01）。凋亡蛋白Bax、Caspase-3、Caspase-9， DCM组均高于空白对照组（P﹤0.01），DCM+BAY606583组表达量较DCM组低（P﹤0.01）。BCL-2抗凋亡蛋白则相反。　　3.4.体外CRISPR-Cas9构建A2B受体基因敲除细胞及A2B受体基因敲除在高糖诱导心肌细胞凋亡中的结果　　3.4.1.腺苷 A2B受体蛋白KO组明显低于对照组（P﹤0.05）。　　3.4.2. TUNEL定性分析可见HG+A2B KO组细胞凋亡高于HG＋BAY606583，流式细胞学定量分析提示HG+A2B KO组细胞凋亡高于HG＋BAY606583　　4. 研究结论　　4.1.腺苷A2B受体激活减缓糖尿病心肌病大鼠心肌细胞的凋亡，但对糖尿病心肌病心肌纤维化的影响不明显。　　4.2.腺苷A2B受体激活减缓糖尿病心肌病大鼠心肌细胞的凋亡，可能通过PI3K/AKT信号途径对心肌起到保护作用的。　　4.3.体外激活高糖诱导的H9C2细胞腺苷A2B受体，从而发挥抗凋亡的作用。这一作用的发挥，PI3K/AKT信号途径可能参与其中。　　4.4.体外敲除H9C2细胞腺苷A2B受体基因，增加了高糖诱导心肌细胞凋亡的凋亡率。