肝癌发病率位列恶性肿瘤的第5位,死亡率列第3位,世界范围内尤以中国为著。目前肝癌的治疗仍以手术为主,并配以放、化疗,但仍有50-80%的病人因复发、耐药在5年内死亡,其原因是这些治疗手段只能杀伤普通的肿瘤细胞,而对导致肿瘤复发转移耐药的具有自我更新、不定向分化、高致瘤性等特点的肿瘤干细胞毫无作用。因此寻找新的、有效的靶向肿瘤干细胞的治疗靶标,对于开发针对肿瘤干细胞的药物或治疗策略,有效治疗导致高死亡率的肿瘤的转移、复发和耐药,具有非常重要的意义。本室在前期工作中通过大容量功能性单抗库/蛋白质组学反向筛选技术筛选获得一株靶向肝癌干细胞的功能性单克隆抗体11C9,通过免疫亲和层析获得其靶抗原,经质谱鉴定为H蛋白。本研究中首先通过免疫共沉淀、细胞免疫荧光共定位及基因沉默对获得的H蛋白进行鉴定,结果均证实11C9单抗识别的抗原蛋白是H蛋白,该蛋白可少量表达于细胞膜表面。免疫组织化学检测发现H蛋白在人肝癌组织和正常肝组织中的表达比例分别为71.8%和8.3%,显著上调表达(p<0.01),且与肝癌的转移(p<0.05)、分化程度(p<0.05)和生存期(p<0.01)显著相关,还是一个独立的预后因子(p<0.05),提示H蛋白的上调表达与肝癌恶性程度密切相关。无血清悬浮培养可以富集肿瘤干细胞。人肝癌细胞MHCC97L亲本、sphere细胞成球率为16.4%和23.2%,BEL7402亲本、sphere细胞的成球率27.2%和37.4%,证明这两株细胞中含有肿瘤干细胞且能被富集。流式细胞技术检测H蛋白在MHCC97L、BEL7402亲本细胞膜表面的表达阳性比例为2.25%、1.78%,而在sphere细胞中的表达阳性比例为17.8%,7.19%,分别富集了7.9倍和4倍。采用流式细胞分选技术分选MHCC97L细胞中膜表面阳性的H+细胞及阴性的H-细胞,在甲基纤维素中进行无血清成球实验,顺铂耐药实验、体内成瘤实验及Transwell小室侵袭实验,结果显示H+MHCC97L细胞成球率为23.6%,H-细胞为15.6%(p<0.01)。H+细胞顺铂耐药的IC50为0.98μg/ml,H+细胞为0.51μg/ml。H+细胞侵袭细胞数为302+14.6,H-细胞为236±14.8(p<0.01)。裸鼠体内成瘤实验显示两株细胞中H+细胞2×102/只接种8-10周出瘤,H-细胞2×104/只接种8周出瘤。以上结果证明细胞膜高表达H蛋白的H+癌细胞具有更强的自我更新、侵袭、耐药、动物体内致瘤能力等肿瘤干细胞相关的显著特征。MHCC97L细胞中CD90+细胞成球率为29.2%,在亲本及sphere细胞中的表达比例为2.37%、7.06%；BEL7402细胞中ESA+细胞成球率为41.2%,亲本及sphere细胞中的表达比例为2.6%、18.7%,两种标志物均表现为肝癌干细胞标志物。H蛋白与MHCC97L中CD90+细胞、BEL7402中ESA+细胞共阳性染色的比例分别为57.1%,40.9%。并且完整肿瘤干细胞球细胞免疫荧光染色结果显示H蛋白能够与肿瘤干细胞标志物CD90及PKH26共阳性染色。表明H蛋白在肝癌干细胞膜表面上调表达,提示H蛋白是肝癌干细胞相关基因(／蛋白)。分选MHCC97L细胞中CD90+H+、CD90+H-、CD90-H+, CD90-H-细胞进行甲基纤维素成球实验、耐药实验及侵袭实验。结果显示四组细胞的成球率分别为28%、15.6%、10.6%、5.4%,顺铂耐药IC50分别为1.18μg/ml,0.88μg/ml,0.69μg/ml, 0.31μg/ml,侵袭细胞数分别为419±22,319±16.6、202±16.9、117±14.1。显示在CD90+肝癌干细胞亚群中,H+肝癌干细胞的自我更新、侵袭、耐药能力依然显著强于H-肝癌干细胞。上述结果表明表达于细胞膜表面的H蛋白在促进肿瘤干细胞的自我更新、侵袭、耐药、动物体内致瘤等肿瘤干细胞相关特征功能方面可能发挥了重要的作用,并可能成为一个潜在的、新的肝癌干细胞分子标志物。11C9功能性抗体抑制H蛋白后体外功能研究显示,成球率由26.6%降为4.2%,(p<0.01),顺铂耐药实验显示IC50由1.5μg/ml降为0.8μg/ml,侵袭穿过细胞由368±10.9降为124±6.7。提示干扰抑制表达于细胞膜表面的H蛋白的功能,可显著抑制肝癌干细胞的自我更新、侵袭、耐药能力等肿瘤干细胞相关生物学功能,表明表达于细胞膜表面的H蛋白在促进肝癌肿瘤干细胞相关生物学功能中发挥了关键性的作用。为进一步研究H基因在肿瘤干细胞中的功能,采用siRNA干扰、小分子抑制干预H蛋白进行体外功能实验显示,siRNA干扰后,干扰组成球率为17.4%,未干扰组为24.4%(p<0.01)。顺铂耐药实验显示IC50由未干扰组的1.24μg/ml降为0.79μg /ml,CD90+肿瘤干细胞比例由4.04%降为1.89%,Transwell侵袭实验细胞由未干扰组的362±23降为2604±24.5(p<0.01)。小分子抑制剂处理后体外功能显示,成球率由21.8%降为9.8%(p<0.01),顺铂耐药实验IC50由1.13μg/ml降为0.65μg/ml,侵袭穿过细胞数由376±22.8降为117±22.4,CD90+肿瘤干细胞比例由4.36%降为1.22%。上述结果进一步确证,抑制H基因的表达或干扰阻断H蛋白的生物学功能可显著抑制肝癌干细胞的自我更新、侵袭、耐药能力等肿瘤干细胞相关生物学功能。体外对MHCC97L亲本细胞进行H基因的siRNA干扰、小分子抑制剂、11C9单抗处理的结果显示,siRNA干扰及小分子处理对亲本细胞增的殖抑制强于抗体干预,以小分子抑制剂最强。结合前述结果,提示表达于细胞膜表面的H蛋白相对可能是一个更特异地靶向肝癌干细胞的靶向治疗新靶点。流式细胞分选MHCC97L中CD90+H+细胞,经11C9功能性抗体处理后进行基因表达谱分析,显示SOX2、Stat3等干性、运动、耐药相关基因及GSK-3p、p-catenin等Wnt信号相关通路基因下调。Western-blot检测显示,小分子抑制剂处理MHCC97L细胞后,H蛋白的表达未出现明显改变,磷酸化GSK3β水平下降,磷酸化P-catenin水平增加,P-catenin的表达减少。提示膜型H蛋白可能通过上调GSK-3β的磷酸化,进而抑制P-catenin的磷酸化和β-catenin的降解,上调β-catenin蛋白的量,从而参与Wnt信号通路激活,发挥对肿瘤干细胞相关生物学功能如自我更新、侵袭、耐药等特性的调节。综上所述,本研究鉴定了通过大容量功能性单抗库／蛋白质组学反向筛选鉴定技术筛选获得肝癌干细胞功能性H蛋白／基因,该蛋白／基因的上调表达与肝癌的恶性程度密切相关。证明了H蛋白膜表面阳性细胞为肝癌干细胞,表达于膜表面的H蛋白通过对Wnt信号通路的调节,在促进肝癌肿瘤干细胞相关生物学功能中发挥了关键性的作用,提示表达于细胞膜表面的H蛋白相对于H蛋白来说可能是一个更特异地靶向肝癌干细胞的靶向治疗新靶点。