研究背景:近年来,终末期肾病（End Stage Renal Disease,ESRD）的临床患病率逐年提高,据美国肾脏病数据系统数据,美国ESRD年患病率为每百万人中有2023.6例人,其主要治疗方法为肾脏移植和透析治疗。尽管近年来相关治疗技术进步较大,但透析患者的死亡率仍然很高;而肾移植肾源紧缺是当前难题,且肾脏移植存在免疫排斥反应,需终生治疗。为突破肾脏替代治疗的局限性,肾脏再生成为研究热点。随着对干细胞研究的不断深入及再生医学的不断发展,应用干细胞进行肾脏再生为终末期肾病患者带来新的希望。干细胞（Stem Cell,SC）是一类具有自我复制功能的多潜能性细胞,在一定的条件下,具有多向地分化形成多种功能性细胞的潜能。随着对干细胞研究的不断深入,干细胞相关的应用范围已涉及了到医学的许多领域。目前,人体的胚胎干细胞已经完全能够实现体外培养过程,包括在体外进行鉴别、分离、纯化、扩增等过程,并且其己经完全可以作为种子的细胞进行下一步的定向分化和培养,已成功培养出人的组织和器官。随着先进的干细胞技术的发展及其对于衍生组织器官的广泛应用,将对一些疾病提供潜在的治疗方法手段及全新的治疗技术,1999年美国《科学》杂志把干细胞的研究列入了排在全球十大基因组测序技术和克隆技术之前的全球十大科学成果中之一。胚胎干细胞（Embryonic stem cells,ESCs）和诱导多能性干细胞（Induced pluripotent stem cells,iPSCs）可以定向分化成为大多数类型的细胞,并有潜力用于修复受损组织。然而,使用ESCs存在伦理问题,因为这些细胞来自早期胚胎的内细胞团,在此过程中细胞团被破坏。相反,iPSCs可以通过上调多能因子从分化的细胞中生成,因此,iPSCs有望为再生医学提供大量难以获得的细胞资源。涉及iPSCs的再生医学研究进展显著,其治疗方法已经开始进行临床试验。此外,患者来源的诱导多能性干细胞有可能产生与疾病相关的特化细胞和相关的类器官,帮助研究人员了解相关疾病潜在的病理生理学。再生医学已越来越成为国内外学者关注的焦点,当前肾脏类器官培育己成为研究新热点,目前已取得突破性的研究进展。由于肾脏结构上和功能上的高度复杂性,肾脏类器官与正常的人肾脏还存在很大差距。首先,肾脏类器官体内移植得到的血管化是来自宿主的细小血管,无法形成成熟的血管网络,缺少功能性的血管灌流系统;其次,尽管肾脏类器官培育能产生肾小球细胞,但肾小球的过滤功能,尿液的排除无法实现。目前,肾脏类器官的体外培养过程并无统一规定的标准,我们在总结多个肾脏类器官诱导方案的基础上,同时针对上述问题,本实验将通过以下研究方法达到提高类肾器官体外诱导成熟度,促进类肾器官体外诱导过程中细胞更好的分化,获得结构更加丰富的类肾器官。研究目的:人诱导性多能干细胞（Human Induced pluripotent stem cells,hiPSCs）由于其扩增性及对发育信号的可塑性,可以诱导分化成肾脏细胞,从而模拟人类遗传肾脏疾病的发病过程。为准确了解肾脏发育过程和肾脏疾病发病机制,并最终能为治疗终末期肾病（End Stage Renal Diseases,ESRD）提供新的治疗思路,本实验将在体外利用人多能诱导性干细胞（hiPSCs）制备肾脏类器官,同时优化肾脏类器官体外培育体系,之后进行体内移植实验,从而进一步促进肾脏类器官在体内发育成熟。研究方法:1.hiPSCs于体外诱导成肾脏类器官,具体为hiPSCs种植于T25培养瓶中,当细胞汇集到一定细胞密度后,开始依次加入CHIR99021、FGF9、肝素（Heparin）定向诱导分化因子,于体外进行至少18天的诱导过程,包括2D平面培养6天,及3D立体诱导12天,最终获得初具肾脏结构及功能特点的类肾组织。2.在进行上述方法构建肾脏类器官的同时,利用hiPSCs来源的肾元细胞进行肾脏类器官的培育,在前期培养基础上,优化肾脏类器官体外培养方案,体外诱导效率相对提高。hiPSCs-肾元细胞是从人多能干细胞（hiPSCs）分化而来的肾元祖细胞（Renal Progenitor Cells,NPC）,利用hiPSCs-肾元细胞进行体外诱导、分化,最终获得肾脏类器官。3.为进一步促进肾脏类器官的成熟,我们将肾脏类器官消化成细胞团的形式,将其注射进入小鼠的肾皮质内,移植后3周开始,将体内类肾器官取出进一步鉴定。目的是研究肾皮质内微环境对肾脏类器官的影响,以及肾脏类器官消化成细胞团后,是否能在体内进一步分化、发育,得出相应结论。研究结果:1.利用hiPSCs培养肾脏类器官培育期间,根据对平面培养时的细胞观察所见,加入诱导因子后的细胞生长密度及形态上均有明显变化。在转3D培养后的第三天开始镜下观察细胞团中出现类似管状结构,并逐渐增多、成熟。体外培养18天后,对肾脏类器官进行相关鉴定,证实体外构建的肾脏类器官中含有大量管状结构。2.同时,为了提高体外肾脏类器官诱导效率,优化肾脏类器官培育条件,我们从hiPSCs-肾元细胞开始诱导,最终成功培育出了肾脏类器官,镜下观察可见大量的管状结构。3.为促进肾脏类器官的进一步分化、发育,本研究将其消化成细胞团注射进入小鼠肾皮质内,体内培养三周后取肾鉴定,经过石蜡切片-HE染色、免疫组化染色鉴定,发现肾脏类器官在肾皮质内进一步成熟,证明小鼠的肾皮质可用于肾脏类器官的体内培养,且创新性地将体外构建的肾脏类器官移植前进行体外的消化处理,使其消化成细胞团的形式,促进其进一步在体内成熟。研究结论:根据上述两种诱导方案,都成功地在体外培育出了肾脏类器官,经鉴定发现,通过两种不同种子细胞构建的肾脏类器官内均有有大量的类管状结构出现。利用hiPSCs-肾元细胞诱导而来的肾脏类器官,经消化后注射进入小鼠肾皮质内。移植3周后取肾鉴定发现,消化后肾脏类器官在小鼠肾皮质内进一步发育成熟,见注射处有人抗原特异性标记的管状结构,证明肾皮质内可促进肾脏类器官的进一步成熟及分化。