人类妊娠时滋养细胞适度浸润至子宫蜕膜、腺体及血管以建立母胎物质交换,是胎盘、胎儿生长发育乃至妊娠得以顺利进行的关键。近十多年来国内外学者经大量的基础实验及临床观察发现,滋养细胞的侵入与肿瘤细胞的侵润过程相似,但前者具有更严格的时间性与空间性。滋养细胞侵入异常可导致多种疾病,侵入不足可导致子宫螺旋动脉重铸障碍,导致自然流产、子痫前期、胎儿生长受限等病理妊娠的发生。葡萄胎是与滋养层细胞密切相关的另一种妊娠疾病,发病机制尚不清楚,其病理特点为滋养细胞良性增生导致水泡状胎块。如果在增生基础上,进一步侵袭至子宫深肌层及血管,则恶变为侵袭性葡萄胎及绒癌等滋养细胞肿瘤。虽然目前有较多有关子痫前期、胎儿生长受限及葡萄胎发病机制的研究,但无一学说可以解释这一类疾病。我们认为,以上疾病的发病过程均与滋养细胞的侵润状态有关,可统称为“滋养细胞侵入异常相关疾病”。随着对滋养细胞侵入异常相关疾病的病理机制及防治研究的不断深入,有学者发现,蜕膜及胎盘等组织局部的内源性因子均参与到了滋养细胞的侵入过程中,其中基质金属蛋白酶及其抑制剂是影响滋养细胞侵入的重要效应因子。滋养细胞通过表达和分泌这些蛋白酶而获得对细胞外基质的降解能力,进而调控滋养细胞的侵入程度,影响妊娠的发展和结局。目前已有文献报道,在子痫前期、胎儿生长受限、葡萄胎及绒癌等滋养细胞侵入异常相关疾病中个别基质金属蛋白酶及其抑制剂的表达异常,但究竟是何种因素造成基质金属蛋白酶及其抑制剂等效应因子的变化尚不知晓。F10基因是本课题组在前期研究中采用抑制性消减杂交法,从葡萄胎与正常早孕绒毛的差异cDNA文库中筛选出的一条新基因(Genbank登录号AB196290)。F10基因在滋养细胞肿瘤、卵巢癌、子宫内膜腺癌及其他肿瘤组织中表达增加,且生物信息学分析结果显示,在细胞分裂中期,F10基因定位于细胞核。初步推论F10是一种参与细胞遗传信息调控的转录因子,并且可能通过促进肿瘤细胞的增生进而参与肿瘤细胞侵袭等调控过程。目前该基因在细胞侵袭过程中的作用研究尚处于初步阶段,并且尚无关于F10在滋养细胞中作用及机制的研究报道。鉴于滋养细胞侵入与肿瘤细胞侵袭的相似性,我们推测葡萄胎发病相关基因F10是否可能通过影响基质金属蛋白酶等滋养细胞侵入调节因子的表达并促进滋养细胞的增生,进而调控滋养细胞的节制性侵入。为了验证上述假说,本研究拟通过检测子痫前期及胎儿生长受限两种滋养细胞侵入过浅疾病患者的胎盘组织中基质金属蛋白酶等侵入调节因子及F10基因的表达水平,了解其在胎盘组织中的表达水平是否存在相关性,以及它们与滋养细胞侵入过浅的关系;同时,检测葡萄胎患者绒毛组织中以上因子的表达水平,寻找滋养细胞侵入调节因子、F10基因与滋养细胞增生过度的关系;最后,针对组织中滋养细胞侵入调节因子及F10基因的异常变化,特异性对人类永生化滋养细胞株进行F10基因过表达及沉默处理,建立稳定过表达及沉默的滋养细胞克隆模型,通过观察F10基因对其增殖及凋亡的影响及分析相应信号通路,初步探讨F10基因在滋养细胞侵入调控过程中的作用,以揭示滋养细胞侵入异常相关疾病发病的分子机制。上述研究对于阐明滋养细胞侵入异常相关疾病的发病机制具有重要意义,为未来指导临床治疗提供新的线索。第一章基质金属蛋白酶表达异常与子痫前期及胎儿生长受限相关性的研究目的子痫前期及胎儿生长受限是母胎发病率及病死率均较高的两种产科疾病。目前普遍观点认为,两种疾病均可由胎盘滋养细胞侵入过浅、子宫螺旋动脉重塑障碍进而发生胎盘供血不足、胎盘功能减退导致。为探讨滋养细胞侵入调节因子基质金属蛋白酶及其抑制剂与滋养细胞侵入过浅病理发生机制的关系,我们逐一检测子痫前期、胎儿生长受限患者及正常妊娠的孕晚期胎盘组织中基质金属蛋白酶及其抑制剂的蛋白表达水平,初步探讨以上侵入调节因子在滋养细胞侵入过浅发病中的作用和意义。方法随机选取2012年1月至2013年6月南方医科大学南方医院妇产科住院分娩孕妇64例作为研究对象,其中子痫前期患者24例,胎儿生长受限患者10例,正常孕妇30例,包括社会指征剖宫产患者15例,阴道分娩患者15例,其中正常阴道分娩患者作为对照组。分别采用Western blot及免疫组化法检测四组胎盘组织中的 MMP-2, -8, -9, -11,-19, MT2-MMP,MT3-MMP,MT5-MMP,TIMP-1及TIMP-3的蛋白表达水平。所有数据资料采用均数±标准差(x±s)表示,采用完全随机设计资料的多组样本均数比较的单因素方差分析(One-way ANOVA),两两比较采用Bonferroni法检验,P<0.05视为有统计学差异。结果1、各组母胎临床资料的比较在子痫前期、胎儿生长受限组的母胎临床资料中,母体年龄、BMI指数、分娩孕周与正常阴道分娩组均无统计学差异(P>0.05)。子痫前期组及胎儿生长受限组中胎盘重量(P<0.001)、胎儿生长受限组胎儿出生体重(P<0.001)均显著低于正常阴道分娩组,差异有统计学意义。正常剖宫产分娩组与正常阴道分娩组相比,以上临床指标均无统计学差异(P>0.05)。2、四组侵袭因子表达水平的比较2.1与正常阴道分娩对照组相比,子痛前期患者胎盘组织中MMP-2、-8、-9、-11蛋白表达水平显著降低(P<0.05),TIMP-1、-3蛋白表达水平显著升高(P<0.05),而 MMP-19、MT2-MMP、MT3-MMP、MT5-MMP 无统计学差异(P>0.05)。2.2与正常阴道分娩组比较,胎儿生长受限患者胎盘组织中MMP-2、MMP-8、MMP-9、MMP-11蛋白表达水平显著降低(P<0.05) , TIMP-1,-3蛋白表达水平显著升高(P<0.05) , MMP-19、MT2-MMP、MT3-MMP、MT5-MMP无统计学差异(P>0.05)。2.3 MMP-2, -8, -9, -11, -19, MT2-MMP, MT3-MMP, MT5-MMP,TIMP-1及TIMP-3在正常剖宫产分娩组胎盘组织中的蛋白表达水平,与正常阴道分娩组相比无统计学差异(P>0.05)。结论本研究结果证实,与正常孕妇相比,子痫前期及胎儿生长受限患者的胎盘组织中多种基质金属蛋白酶MMP-2、-8、-9、-11的表达水平异常下调,基质金属蛋白酶抑制剂TIMP-1, -3的表达水平异常上调,可能是子痫前期及胎儿生长受限发病的原因之一。MMP-19, MT2-MMP、MT3-MMP、MT5-MMP的表达水平无显著差异,其可能未参与子痫前期及胎儿生长受限的发病过程或对其影响较小。第二章新基因F10在子痫前期及胎儿生长受限胎盘组织中的表达目的前述研究已证实,子痫前期及胎儿生长受限患者胎盘组织中基质金属蛋白酶及其抑制剂表达异常,提示可能与滋养细胞浅侵入相关,然而是何种原因导致这些侵入效应因子异常表达不得而知。F10基因是本课题组前期获得的一条定位于细胞核且与葡萄胎发病相关的新基因,F10基因在多种肿瘤组织中表达,并在葡萄胎、侵袭性葡萄胎及绒癌中呈阳性表达且强度依次递增,提示可能与滋养细胞的侵袭行为有关。鉴于F10基因可能作为转录因子参与滋养细胞的侵入行为,我们推测F10基因同样可能参与子痫前期及胎儿生长受限的发病。我们通过检测F10在子痫前期及胎儿生长受限患者胎盘中的表达情况,探讨F10基因、滋养细胞侵入因子与子痫前期及胎儿生长受限发病的关系。方法子痫前期、胎儿生长受限、正常剖宫产分娩及正常阴道分娩者的胎盘标本来源及分组同第一章,均随机取自南方医科大学南方医院妇产科住院分娩孕妇。分别采用Western blot及免疫组化法检测四组胎盘组织中F10蛋白的表达水平。所有数据资料采用均数±标准差(x±s)表示,采用完全随机设计资料的多组样本均数比较的单因素方差分析(One-wayANOVA),两两比较采用Bonferroni法检验。P<0.05视为有统计学差异。结果1、子痫前期患者胎盘组织F10蛋白表达降低我们分别采用Western blot及免疫组化染色法检测了子痫前期、胎儿生长受限、正常剖宫产分娩患者胎盘组织中F10蛋白的表达水平。子痫前期胎盘组织中F10蛋白条带明显弱于对照组标本。半定量分析结果显示,与正常阴道分娩组相比,子痫前期组F10蛋白表达水平降低(P=0.001)。免疫组化法检测的半定量结果显示,与正常阴道分娩组比较,子痫前期组F10表达水平显著降低(P=0.001)。2、胎儿生长受限患者胎盘组织中F10蛋白表达降低实验结果显示F10蛋白表达水平在胎儿生长受限组中显著低于对照组,差异有统计学意义(P=0.001)。免疫组化的半定量结果与Western blot结果吻合,胎儿生长受限患者胎盘组织中F10蛋白表达量显著低于对照组(P=0.002)。3、正常剖宫产分娩及正常阴道分娩患者胎盘组织中的F10蛋白表达水平无显著差异F10蛋白在正常剖宫产分娩组胎盘组织中的表达水平与正常阴道分娩组无统计学差异(P>0.05)。结论我们的实验结果显示,子痫前期与胎儿生长受限患者胎盘组织中F10异常下调,提示F10参与了子痫前期与胎儿生长受限的病理生理过程,可能是滋养细胞侵入相关的调控因子。此外,F10基因在子痫前期及胎儿生长受限患者胎盘中与MMP-2、-8、-9、-11蛋白表达水平同时下调,而基质金属蛋白酶抑制剂TIMP-1、TIMP-3的表达上调,三者的异常表达存在一定相关性,说明F10基因可能通过调控下游因子基质金属蛋白酶及其抑制剂的表达进而影响滋养细胞的侵入行为。第三章基质金属蛋白酶与F10基因在葡萄胎组织中的表达及其可能参与滋养细胞侵袭调节的机制目的葡萄胎是另外一种与滋养细胞密切相关一种良性疾病,具体病因不明,其主要病理表现为滋养细胞增生旺盛,易侵入子宫壁血窦,可恶变为侵袭性葡萄胎及绒癌。葡萄胎发病与恶性转化机制至今不明。前述研究发现F10可能通过调控基质金属蛋白酶及其抑制剂的表达进而参与滋养细胞侵入过浅的两种代表性疾病-子痫前期及胎儿生长受限的发病。作为葡萄胎发病相关基因F10,是否通过调控基质金属蛋白酶及其抑制剂的表达进而影响滋养细胞侵袭行为?我们通过检测葡萄胎组织中F10基因、基质金属蛋白酶及其抑制剂的表达水平,进一步探讨F10基因与葡萄胎发病的相关性及其可能的机制。方法随机选取2012年1月至2013年12月南方医科大学南方医院妇产科住院及门诊清宫的孕妇12例作为研究对象,其中葡萄胎患者6例作为实验组,正常早孕者6例作为正常对照组。分别采用Western blot及免疫组化法检测两组绒毛组织中的 MMP-2, -8, -9, -11,-19, MT2-MMP,MT3-MMP,MT5-MMP,TIMP-1及TIMP-3的蛋白表达水平。所有数据资料采用均数±标准差(x±s)表示,采用完全随机设计资料的两组样本均数比较的t检验。P<0.05视为有统计学差异。结果1、两组患者临床资料比较葡萄胎患者与正常早孕者绒毛相比较,母体年龄与孕周均无统计学差异(P>0.05)。2、葡萄胎绒毛组织中MMP-2、-8、-9、-11蛋白表达水平显著升高,TIMP-1、-3蛋白表达水平降低Western blot结果显示,葡萄胎绒毛组织中MMP-2 (P<0.001)、-8(P=0.002)、-9 (P<0.001)、-11 (P<0.001)蛋白含量高于正常早孕组,差异有统计学意义,而MMP-19、MT2-MMP、MT3-MMP、MT5-MMP无显著变化(P>0.05)。葡萄胎患者绒毛组织中的TIMP-1 (P=0.003)、-3 (P<0.001)蛋白表达水平均低于正常早孕组。免疫组化染色结果显示,葡萄胎绒毛组织中MMP-2 (P=0.004)、-8(P=0.004)、-9 (P=0.001)、-11 (P=0.003)表达显著高于正常早孕组;MMP-19、MT2-MMP、MT3-MMP及MT5-MMP的表达没有显著差异(P>0.05)。葡萄胎患者绒毛组织中的TIMP-1 (P=0.004)、-3 (P<0.001)蛋白表达水平均低于正常早孕组。3、葡萄胎绒毛组织中F10蛋白表达水平显著升高我们进一步检测了葡萄胎绒毛组织中F10蛋白的表达水平。Western blot结果显示,在葡萄胎患者绒毛组织中,F10蛋白表达水平显著高于正常早孕组(P<0.001)。免疫组化半定量结果显示,与正常早孕组绒毛组织相比,葡萄胎患者绒毛组织中的F10蛋白表达水平上调(P=0.004)。结论根据本实验结果显示,葡萄胎患者绒毛组织中的F10与基质金属蛋白酶MMP-2、-8、-9、-11蛋白的表达同时异常上调,而基质金属蛋白酶抑制剂TIMP-1、-3蛋白表达降低,说明F10基因及侵袭调节因子表达异常是葡萄胎的发病因素之一,F10基因、基质金属蛋白酶及其抑制剂的表达异常在滋养细胞侵入行为上具有一定相关性,再次证实F10基因可能通过影响基质金属蛋白酶及其抑制剂下游因子的表达进而参与对滋养细胞侵入行为的调控。第四章F10基因参与滋养细胞增殖调节的机制研究目的如前所述,我们已证实滋养细胞侵入异常相关疾病患者的胎盘或绒毛组织中F10、基质金属蛋白酶及其抑制剂表达异常,且三者存在一定相关性,提示上游基因F10可能通过上调基质金属蛋白酶及下调基质金属蛋白酶抑制剂的表达而提高滋养细胞侵润能力。作为滋养细胞侵入子宫基质的前提之一,妊娠早期滋养细胞的增殖程度是影响其浸润深度的另外一个重要因素。那么,F10基因是否也可以通过影响其增殖及凋亡而改变滋养细胞的浸润能力。本实验拟以F10基因过表达与沉默的单克隆滋养细胞株为体外模型,研究其对细胞增殖及凋亡的影响及相关的信号通路。方法针对F10基因分别设计并构建F10基因稳定过表达及沉默的HTR8/Svneo单克隆细胞,而未处理的HTR8/SVneo细胞作为正常对照组。经过体外培养后,分别采用MTT法绘制三组细胞的生长曲线、免疫荧光法比较细胞增殖标记物PCNA及CyclinE蛋白的表达水平、流式细胞术检测Annexin V/PI及Western blot检测凋亡分子Caspase-3 了解早期凋亡差异、Western blot检测细胞增殖相关信号通路蛋白MEK、ERK、PI3K及STAT3表达差异情况。所有数据资料采用均数±标准差(x±s)表示,MTT结果采用析因方差分析法,其他多组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),两两比较采用Bonferroni法检验。P<0.05视为有统计学差异。结果1、成功建立F10基因稳定过表达及沉默的单克隆滋养细胞模型对F10基因过表达、沉默及正常的HTR8/SVneo三组细胞行RT-PCR验证,结果提示F10过表达组、正常对照组及F10沉默组的CT值逐渐降低,且差异有统计学意义(P<0.001)。行Western blot验证,结果提示F10蛋白条带灰度值在过表达组强度最高,其次分别为正常对照组及F10沉默组,差异均有统计学意义(P<0.001)。2、F10基因促进滋养细胞增殖2.1 MTT结果显示,每组细胞随时间的延长,其增殖差异具有显著性,除第一天外,其余时间点过表达组细胞较正常组及沉默组细胞生长增快,其差异有统计学意义(P<0.001)。2.2我们分别使用PCNA及CyclinE对三组细胞进行荧光染色。与正常对照组相比,经F10基因过表达处理后,细胞中PCNA (P<0.001)及CyclinE(P<0.001)荧光强度高,蛋白表达量增多,差异均具有统计学意义,而F10基因沉默组与正常对照组相比无显著差异(P>0.05)。3、F10基因抑制细胞凋亡3.1采用流式细胞术检测三组细胞的早期凋亡比例。结果显示,F10过表达组早期凋亡细胞比例明显低于正常细胞组,差异有统计学意义(P<0.001), F10沉默组与正常组相比无统计学差异(P>0.05)。3.2在Western blot结果中,F10过表达组Caspase-3条带细且强度低,半定量结果显示,与对照组相比,过表达组Caspase-3蛋白表达显著下调(P<0.001)。F10基因沉默组Caspase-3的表达水平与正常组相比无显著差异(P>0.05)。4、F10基因对增殖相关信号通路蛋白表达的影响分别检测了增殖相关信号通路中部分信号蛋白在三组细胞中的表达水平,了解F10基因促进滋养细胞增殖的分子机制。实验结果显示,在F10基因过表达组中,磷酸化MEK1/2 (P<0.001)及ERK1/2 (P<0.001)蛋白表达水平显著高于正常对照组,而总蛋白含量无显著差异(P>0.05),而F10过表达组中磷酸化及总蛋白的PI3K及STAT3均无显著差异(P>0.05)。此外,我们还检测了 F10基因沉默组中以上信号蛋白磷酸化形式及总蛋白的含量,但与正常组相比无统计学差异(P>0.05)。结论以F10基因过表达及沉默的HTR8/SVneo细胞克隆为模型,探讨F10基因对滋养细胞增殖的影响及其分子机制。实验结果显示,F10基因过表达的滋养细胞生长速度增快、细胞增殖标记物表达增多、早期凋亡比例减少,提示F10基因有促进滋养细胞增殖、抗凋亡的作用。过表达细胞中MEK1/2及ERK1/2信号蛋白异常上调,提示F10基因可通过激活MEK/ERK信号通路,调控滋养细胞的增殖及凋亡。全文小结1、与正常胎盘相比,子痫前期及胎儿生长受限患者胎盘组织中基质金属蛋白酶MMP-2,MMP-8,MMP-9,MMP-11的表达水平异常下调,其抑制剂TIMP-1,TIMP-3表达上调,提示基质金属蛋白酶及其抑制剂表达异常可能是滋养细胞浅侵入的发病机制之一。2、在MMPs蛋白表达下调的子痫前期及胎儿生长受限的胎盘组织中F10基因的蛋白表达水平同时出现下调,提示F10可能作为转录因子对基质金属蛋白酶及其抑制剂等下游因子进行转录调控进而参与调控滋养细胞的侵入行为。3、F10基因在葡萄胎绒毛组织中与基质金属蛋白酶的表达水平同时异常上调,进一步验证F10基因可能是基质金属蛋白酶及其抑制剂的上游因子,其通过影响下游因子基质金属蛋白酶及其抑制剂的表达水平,进而调控滋养细胞过度侵入子宫内膜的行为。4、F10过表达的滋养细胞增殖水平增强,凋亡比例减少,结合前述研究,提示F10基因不仅可通过改变基质金属蛋白酶等侵入调节因子的表达水平,还可通过MEK/ERK通路信号影响滋养细胞的增殖和凋亡来调控滋养细胞的侵润能力。