目的:表皮是皮肤的最外层,角质形成细胞是表皮的主要组成细胞,约占80%-95%。角质形成细胞易受多种外源性和内源性刺激导致的损伤。外源性刺激常见的有紫外线,烟雾,空气污染及病原体等,而内源性刺激常见的有毒素、氧化和糖化等。内源性和外源性损伤可以通过活性氧自由基(reactiveoxygen species,ROS),糖化(glycation),或炎症反应等方式造成细胞损伤。石榴提取物中的活性成分有着广泛的生物学效应,其对人体的药理作用主要体现在抗氧化、抗糖化、抗肿瘤、抗感染、抗紫外线损伤等方面。前人研究发现石榴中的多种天然产物具有皮肤保护活性。研究报道石榴提取物能够通过抗氧化作用减轻UVB的角质形成细胞毒作用。石榴提取物中的主要成分,多酚类化合物安石榴甙(punicalagins,PA)(占约30%),能够减轻UVA和UVB诱导的人成纤维细胞的氧化应激和炎症反应。研究发现石榴提取物具有光化学保护作用,可以通过调节STAT3,PKB,MAPK和NF-κB等通路减轻UVA和UVB诱导的角质形成细胞损伤,体内实验验证口服石榴提取物的光保护作用获得了相似的结果。此外,随机双盲安慰剂对照对照实验也验证了 PA的水解产物,高鞣花单宁酸(ellagic acid,EA),具有光化学保护作用,并能抑制皮肤内的色素生成。石榴提取物中EA的肠道代谢产物尿石素(urolithinA,UA),同样具有抗氧化和减轻色素生成的作用。研究发现石榴提取物还具有抗糖化作用,能够抑制MGO(Methylglyoxal,丙酮醛)诱导的糖化反应和AGE(Advanced Glycation End Products,糖化终末产物)形成,并显著降低高糖高脂饮食小鼠体内的AGE。石榴提取物能抑制poly(I:C)诱导的角质形成细胞分泌的多种炎症因子,EA在巨噬细胞中可以显著抑制LPS诱导的IL-1β的分泌。本研究组前期开展了石榴不同部位的提取分离工作,发现并鉴定了百余种多酚类天然产物。此外,研究组前期开展标准化的石榴提取物(pomegranateextract,Pomella(?),PE)及其主要多酚类化合物PA,EA和UA对Alzheimer病的神经保护作用,抗神经细胞炎症作用和抗糖化作用。H2O2,MGO和poly(I:C)分别是常用的氧化应激诱导剂,糖化反应诱导剂和NLRP3炎症小体诱导剂。目前尚无PE,PA,EA和UA对H2O2诱导的角质形成细胞氧化应激损伤,对MGO诱导的角质形成细胞糖化损伤,和对poly(I:C)诱导的角质形成细胞NLRP3炎症小体损伤的保护作用及机制研究。目前有研究发现石榴提取物能够通过影响特定的miRNA发挥抗炎和抑制乳腺癌生长的作用,皮肤科的Paget病与乳腺癌具有相似组织学特点和免疫组化标记物,本研究组前期也发现乳房外Paget病(extramammary Paget’s disease,EMPD)存在特异性表达的miRNA,并可能发挥促炎促肿瘤作用。因此,本研究拟检测应用PE及其多酚类天然产物PA,EA和UA对H2O2诱导的角质形成细胞损伤的保护作用;对MGO诱导的角质形成细胞糖化损伤的保护作用;对poly(I:C)诱导的角质形成细胞NLRP3炎症小体损伤的保护作用,以及EMPD的miRNA研究。研究结果将有助于支持PE及其多酚类天然产物在皮肤科相关领域的应用。研究方法:1.实验对象研究所用的永生化人角质形成细胞系(HaCaT细胞)来自于Providence College生物实验室,原代人角质形成细胞(HEKa细胞)购自GIBCO公司(C-005-5C)。本研究2014年至2017年间纳入16名EMPD患者,12名阴囊湿疹或股癣患者,纳入17名年龄相仿的健康受试者,获取患者临床信息及组织血清标本,本研究获中国医科大学附属第一医院伦理委员会批准通过,项目编号为:No.AF-SOP-07-1.0-01。2.活性氧自由基检测HaCaT细胞分别应用含不同浓度的检测药物孵育后,再加入H2O2孵育,随后应用含有荧光染液DCFDA(20μM)的培养基孵育20分钟,然后用分光光度仪检测每孔细胞的吸光度(Ex/Em:485/535nm)。3.检测不同浓度的检测药物/H202/MGO诱导的细胞毒性作用HaCaT细胞/HEKa细胞分别应用含不同浓度的检测药物/H2O2/MGO培养液孵育或先后孵育后,加入CTG检测试剂,放置在摇床上2分钟(200转/分)。室温静置10分钟后应用Spectramax M2 plate reader检测荧光信号强度。细胞孵育后用75%乙醇固定细胞15分钟,加入结晶紫染液(0.05%w/v)孵育20分钟,PBS冲洗,显微镜下检测拍照。4.检测H202/MGO诱导的细胞凋亡HaCaT细胞先后应用含不同浓度的检测药物孵育12小时及H2O2/MGO培养液孵育24小时。消化重悬细胞,500μl的PBS内加入5μl的FITC标记的Annexin-V和5μl的propidiumiodide(PI)染色15分钟。应用流式细胞仪检测,并用FlowJo软件分析数据。5.检测caspase-3/7,-8,-9水平HaCaT细胞先后应用含不同浓度的检测药物孵育12小时及100μl的H2O2培养液孵育24小时,随后加入100 uL ofcaspaseGloreagent(用于检测caspase-3/7,-8,-9的水平),孵育30分钟后在Spectramax M2 platereader检测荧光信号强度。6.检测DNA链完整性HaCaT细胞先后用检测药物孵育2小时及含MGO(400μM)的培养液孵育24小时。消化重悬后用LMAgarose(低熔点琼脂糖)作1:10稀释,加到Comet玻片上,4℃裂解过夜,碱性解螺旋溶液中浸泡20分钟,碱性电泳液行核酸电泳(21v,30分钟),固定干燥,SYBRGOLD染液染色拍照,CASP软件分析。7.DNA寡核苷酸合成糖化检测和LC Mass分析利用固相磷酰胺化学法合成了 9个序列为5’-TTTTGTTTT-3’的单链DNA寡核苷酸。糖化过程在37℃,PH=7.4条件下进行,用上述合成的单链DNA(200μM)与检测药物和MGO在PBS中反应。LC Mass(全称)分析在负离子模式下进行,液相色谱分离应用的分离柱为 Thermo Scientific Accucore 150 Amide HILIC Column(3×100 mm;2.6 μm),流速0.3ml/分。使用SCIEX分析软件TF 1.7进行数据分析。8.细胞黏附迁移能力检测HaCaT细胞先后用检测药物孵育2小时及含MGO(400μM)的培养液孵育24小时,用CTG检测即刻各组细胞总量和10小时组PBS冲洗后剩余贴壁细胞量,计算黏附细胞比率。应用Transwell检测细胞的迁移能力,结晶紫染色拍照,乙醇脱色Spectra检测脱色液吸光度(570nm)定量迁移细胞量。9.检测细胞上清中的IL-1β含量HaCaT细胞和HEKa细胞先后应用不同浓度的待测药物和poly(I:C)(0.3g/ml或0.6g/ml)与脂质体(Lipofectamin)的混合液处理,收集上清液。应用Elisa试剂盒各组检测上清中IL-1β含量。10.检测NLRP3,ASC,CASP-1 和pro-IL-1 β 的转录HEKa细胞应用EA或UA及poly(I:C)处理后,提取RNA,逆转录,应用NLRP3,ASC,CASP-1和pro-IL-1β引物实行qPCR检测。系统自动设定阈值,获得相应Ct值。11.检测线粒体ROS和线粒体膜电位水平HEKa细胞应用EA或UA及poly(I:C)处理后,分别应用Mito Sox Red或Mito Tracker Red染液染色,流式细胞仪检测;HEKa细胞应用EA或UA及poly(I:C)处理后,分别应用 Hochester33342 和 Mito Sox Red 的混合液,或 Hochester33342和Mito Tracker Red的混合液双染细胞,固定,共聚焦显微镜拍照检测。12.EMPD原代细胞培养EMPD患者肿瘤组织手术切除后浸泡于生理盐水中,迅速转移至实验室,开展原代培养。将瘤体组织置于离心管中,用Dispase酶37℃水浴90分钟,后修剪分离真表皮,将组织剪碎,转移组织碎块悬液至离心管中,离心去上清,加入胰酶吹打混匀,在37℃水浴锅中振摇15分钟。中和胰酶后反复冲洗离心混匀过滤,用含10%FBS的RPMI培养基培养,观察,定期换液,传代,冻存。13.miRNA芯片检测及全局标化分析EMPD患者及健康受试者提取总RNA,逆转录,预扩增,应用Human MicroRNA array card v2.0 plate A检测获得 miRNA 表达谱。使用 SDS 2.3 and RQ manager 1.2软件,应用默认基线和阈值获得全部表达谱Ct值,数据输入至StatMiner(?)4.2软件进行全局标化分析。应用hierarchical clustering软件,根据各样本miRNA的Δ Ct值制作热图分析。14.检测差异表达的miRNAs根据miRNA芯片获得的差异表达miRNAs,应用qPCR验证指定miRNAs在实验组和对照组的表达水平。15.数据统计应用GraphPad Prism 6软件进行数据统计分析。组内重复计算均值和标准差,组间用 one-way analysis of variance 和 Newman-Keuls 进行多组间比较计算。P<0.05,P<0.01或P<0.001被认为是有显著性差异。结果:1、石榴提取物对H2O2诱导的角质形成细胞损伤的保护作用发现石榴提取物PE,PA和EA可抑制H2O2诱导的HaCaT细胞活性氧自由基的生成;PE,PA和UA可抑制H2O2诱导的HaCaT细胞活力下降;PE,PA和UA可抑制H2O2诱导的HaCaT细胞凋亡;PE,PA和UA可抑制H2O2诱导的HaCaT细胞Caspase-3/7的升高。2、石榴提取物对MGO诱导的角质形成细胞损伤的保护作用发现MGO能够诱导HaCaT细胞活力下降,不影响细胞凋亡,诱导HaCaT细胞DNA链断裂。MGO能与鸟嘌呤结合,导致HaCaT细胞黏附和迁移能力降低;PE和PA能与MGO结合减轻其诱导的上述损伤,具有抗糖化作用。3、石榴提取物对poly(I:C)诱导的角质形成细胞损伤的影响发现poly(I:C)能够诱导HEKa细胞NLRP3炎症小体启动激活并分泌IL-1β;PE,EA和UA能抑制poly(I:C)诱导的HEKa细胞分泌IL-1β;EA能够抑制poly(I:C)诱导的HEKa细胞NLRP3炎症小体启动过程和激活过程,具有抗炎作用。4、EMPD血清miRNA表达谱检测获得了 EMPD血清miRNA表达谱,并通过验证实验发现miR-155在EMPD患者血清中显著高表达,而在正常志愿者和鉴别诊断疾病之间无明显差异,miR-155有潜力成为EMPD的辅助诊断标记物。结论:1、PE和PA可抑制H2O2诱导的HaCaT细胞损伤,具有抗氧化保护作用。2、PE和PA降低MGO诱导的DNA糖化及HaCaT细胞损伤,具有抗糖化保护作用。3、PE,EA和UA能够抑制poly(I:C)诱导的HEKa细胞分泌IL-1β,其中EA能够抑制poly(I:C)诱导的HEKa细胞NLRP3炎症小体启动和激活,具有抗炎作用。4、获得了 EMPD血清miRNA表达谱,并发现miR-155在EMPD患者血清中显著高表达,有潜力成为EMPD的辅助诊断标记物。