D-氨基酸广泛存在于微生物、植物和动物中,是非天然氨基酸,因其特殊的生物学性质,成为越来越重要的医药、食品添加剂和其他不同工业的中间体。D-氨基酸的制备方法有手性拆分外消旋体法、化学法、生物酶法和发酵法等,相较于化学合成或化学拆分,生物合成或生物拆分可获得光学纯度高的D-氨基酸,清洁环保,符合现代工业可持续发展的要求,具有广阔的工业化应用前景。本文采用双酶级联反应酶法合成了一系列D-氨基酸,包括D-天冬氨酸、D-赖氨酸、D-别苏氨酸、D-色氨酸,涵盖了酸性、碱性、中性三大类氨基酸。具体工作如下:1.利用基因工程分子克隆技术,分别在原核表达系统pETDuet-1和pGEX-KG中重组表达了氨基酸消旋酶（AAR）,构建出两株基因工程菌,分别是pETDuet-1-AAR/BL21（DE3）和 pGEX-KG-AAR/BL21（DE3）,分别简称 D-AAR 和K-AAR。氨基酸消旋酶催化L-氨基酸转化为DL-氨基酸,探究并比较两个酶的酶学性质,确定氨基酸消旋酶的最佳转化条件为:转化温度40℃,pH 7.0,4mM PLP,具有广泛底物特异性;同时通过比较得出在最佳条件下,K-AAR活性高于 D-AAR。通过对K-AAR的发酵优化,确定发酵工艺为:温度30℃,pH 7.5,转速200 rpm,装液量20 mL/100 mL,摇瓶发酵时间14 h;同时利用5 L发酵罐探究氨基酸消旋酶的工业化发酵工艺,根据菌种生长过程曲线,确定发酵接种的菌种龄10 h,发酵罐发酵时间15h,可以获得高质量和高产量的酶制剂。2.建立氨基酸消旋酶和天冬氨酸-β-脱羧酶双酶级联高效生产D-天冬氨酸的方法:利用氨基酸消旋酶全细胞催化消旋L-天冬氨酸获得DL-天冬氨酸,去除氨基酸消旋酶后再利用天冬氨酸-β-脱羧酶全细胞对消旋产物生物拆分,得到D-氨基酸,最终D-天冬氨酸收率达47%,理论收率50%,对映体过量值（e.e.值）=97%。3.建立了氨基酸消旋酶和赖氨酸脱羧酶双酶级联高效生产D-赖氨酸的方法:利用氨基酸消旋酶全细胞催化消旋L-赖氨酸获得DL-赖氨酸,去除氨基酸消旋酶后再利用赖氨酸脱羧酶全细胞对消旋产物生物拆分,得到D-赖氨酸。最终D-赖氨酸收率达42%,对映体过量值（e.e.值）=98%,理论收率50%。4.建立了氨基酸消旋酶和苏氨酸脱氨酶双酶级联高效生产D-别苏氨酸的方法:利用氨基酸消旋酶全细胞催化消旋L-苏氨酸获得L-苏氨酸和D-别苏氨酸的外消旋体混合物,去除氨基酸消旋酶后再利用苏氨酸脱氨酶全细胞对消旋产物生物拆分,得到D-别苏氨酸。最终D-别苏氨酸收率达46.8%,理论收率50%,对映体过量值（e.e.值）=95%。5.建立了氨基酸消旋酶和色氨酸酶双酶级联高效生产D-色氨酸的方法:利用氨基酸消旋酶全细胞催化消旋L-色氨酸获得DL-色氨酸,去除氨基酸消旋酶后再利用色氨酸酶全细胞对消旋产物生物拆分,得到D-色氨酸。最终D-色氨酸收率达45.5%,理论收率50%,对映体过量值（e.e.值）=94%。双酶级联生物合成D-氨基酸是基于酶法拆分外消旋体建立的合成路线,不同的是该路线以L-氨基酸为起始原料。一方面氨基酸消旋酶消旋成本远远低于化学消旋,另一方面选用选择专一性的酶进行酶法拆分。双酶级联法简化了生物合成D型氨基酸的制备,为制备D型氨基酸提供了一种新方法。