论文部分内容阅读
本文分两个部分进行探讨: 第一部分：pEGFP-N1-CatSper1 DNA疫苗在小鼠体内的表达及引发的免疫反应 目的：检测pEGFP-N1-CatSper1重组质粒接种到雄性小鼠体内后的表达及引发的特异性免疫反应。 方法：少量提取质粒pEGFP-N1-CatSper1，若酶切鉴定结果正确则进行去内毒素质粒大量提取，测浓度及纯度后，调节浓度至0.5μg/μl备用。取200μl pEGFP-N1-CatSper1、PBS肌肉注射于雄性小鼠的双后肢大腿肌肉处，隔周注射一次，共注射3次。分别在初次免疫后12、24、48h取注射部位组织提取总RNA，通过逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测CatSper1 mRNA的表达。分别在初次免疫后24、48、72h取注射部位组织做冰冻切片，激光共聚焦显微镜下观察增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的荧光以检测CatSper1蛋白的表达。通过酶联免疫吸附测定（ELISA）检测pEGFP-N1-CatSper1注射组小鼠免疫前及初次免疫后1、3、5w的血清中抗CatSper1 IgG抗体的滴度。 结果：pEGFP-N1-CatSper1双酶切产物中可见两条分别约为5kb、2kb的条带，鉴定结果正确。大量提取的质粒的OD260/OD280在1.8-2.0，符合体内注射的要求。pEGFP-N1-CatSper1注射组RT-PCR结果为CatSper1 mRNA阳性，PBS注射组则为阴性。激光共聚焦显微镜下，pEGFP-N1-CatSper1注射组细胞有较强的绿色荧光，PBS注射组仅见少许自发荧光。pEGFP-N1-CatSper1注射组小鼠血清中可检测到特异性抗CatSper1 IgG抗体，抗体滴度先逐渐上升，在初次免疫后3w达到高峰，然后逐渐下降。 结论：pEGFP-N1-CatSper1 DNA疫苗的目的基因CatSper1可在哺乳动物体内正常转录、翻译并引发特异性免疫反应。 第二部分：pEGFP-N1-CatSper1 DNA疫苗对雄性小鼠的抗生育效果 目的：研究pEGFP-N1-CatSper1 DNA疫苗对雄性小鼠的抗生育效果。 方法：取200μlpEGFP-N1-CatSper1、pEGFP-N1（0.5μg/μl）通过肌肉注射的方法免疫雄性小鼠，隔周注射一次，共注射3次。末次免疫后1w将雄鼠与雌鼠按1:2的比例连续合笼2w，合笼后8h内检查雌鼠阴栓，查到阴栓后14 d处死雌鼠计数宫腔内的胚胎数。交配试验结束后处死雄鼠，取一侧睾丸、附睾用于观察其组织结构；取另一侧附睾尾精子，检测精子浓度、活力及超活化运动。 结果：pEGFP-N1-CatSper1注射组小鼠生育率（40.91％）明显低于pEGFP-N1注射组（P=0.012），但交配率（90.91％）及平均每胎产仔数（10.9±0.9）与pEGFP-N1注射组无明显差异。pEGFP-N1-CatSper1注射组小鼠精子前向运动率（（36.31±2.43）％）及超活化运动率（（8.09±1.23）％）明显下降（P<0.001），但睾丸、附睾组织无病理性改变，精子浓度（（3.06±0.38）/ml）及精子总活力（（59.01±6.35）％）与pEGFP-N1注射组也无明显差异。 结论：pEGFP-N1-CatSper1 DNA疫苗有较好的抗生育效果，具有较好的避孕潜能。