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观察脯氨酸羟化酶2(prolyl hydroxylase domain 2, PHD2)和内脏脂肪素(visfatin)在糖尿病大鼠视网膜中的表达情况,发现早期糖尿病大鼠视网膜中PHD2和visfatin呈高表达,揭示了PHD2和visfatin在糖尿病视网膜病变发生发展过程中可能起重要作用。通过探讨在糖尿病视网膜病变动物模型中PHD2和visfatin的作用机制,寻找糖尿病视网膜病变治疗的新靶点。第一部分 脯氨酸羟化酶2在糖尿病大鼠视网膜中的表达及意义目的观察脯氨酸羟化酶2 (prolyl hydroxylase domain 2, PHD2)在糖尿病大鼠视网膜中的表达情况,探讨在糖尿病视网膜病变动物模型中PHD2的作用机制,寻找糖尿病视网膜病变治疗的新靶点。方法 (1)早期糖尿病动物模型的制作：采用0.001mmol/L柠檬酸盐缓冲液配成10g/L的链脲佐菌素(streptozotocin, STZ),实验组大鼠45只,对照组大鼠15只,按60mg/kg剂量在大鼠左下腹腔内注射,72h后取大鼠尾血测血糖。将血糖≥16.7mmol/L的大鼠确定为糖尿病大鼠的模型,对照组大鼠腹腔注射柠檬酸盐缓冲液。(2)建模成功的糖尿病大鼠定期检测血糖和测量体重,并记录。建立模型8w后对眼部标本进行病理切片,行免疫荧光化学染色及苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining, HE),观察大鼠视网膜组织的病理改变及PHD2、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)等因子在视网膜组织中的分布与表达情况,观察PHD2主要表达于何种视网膜组织细胞,分析PHD2与其他血管增生因子的相关关系。(3)早期糖尿病大鼠眼内因子mRNA表达检测：应用RT-PCR方法检测PHD2、VEGF、GFAP等因子mRNA在眼内的表达情况。结果(1)糖尿病大鼠的体重随时间推移先增后减,血糖始终维持在高水平,与对照组比较,有统计学意义(p<0.01)(2)视网膜冰冻切片HE染色结果：光镜下糖尿病大鼠组视网膜各层增厚,排列紊乱,部分血管呈扩张趋势,并可见色素上皮细胞增生。与糖尿病大鼠组相比,正常对照组大鼠可见视网膜组织表面光滑,各层结构清晰完整,细胞排列整齐。(3)免疫荧光染色：在正常大鼠视网膜中,PHD2不表达,GFAP及VEGF主要在星形胶质细胞中表达,其余各层组织不表达；但在早期糖尿病大鼠视网膜全层中可见PHD2、GFAP及VEGF染色均为强阳性,以神经胶质细胞表达为主,PHD2与VEGF和GFAP共表达。(4)实验组PHD2、GFAP及VEGF mRNA表达水平较正常对照组明显增高,差异有统计学意义(p<0.01)。结论早期糖尿病大鼠视网膜中PHD2呈高表达可能由局部高浓度血糖诱导神经胶质细胞分泌产生,进而促进VEGF、GFAP的表达增高,PHD2在糖尿病视网膜病变发生发展过程中可能起重要作用。第二部分 内脏脂肪素和血管内皮生长因子在早期糖尿病大鼠视网膜中的表达及意义目的观察内脏脂肪素(visfatin)和血管内皮生长因子(vascular endothelial factor, VEGF)在糖尿病大鼠视网膜中的分布特点和表达情况,探讨visfatin和VEGF在糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy, DR)动物模型中的作用机制,寻找糖尿病视网膜病变治疗的新靶点。方法 (1)早期糖尿病动物模型的制作：将60只雄性SPF级SD大鼠按随机数字表法分为糖尿病组和对照组各30只。采用0.001mmol/L柠檬酸盐缓冲液配成10g/L的链脲佐菌素(streptozotocin, STZ),糖尿病组大鼠腹腔一次性注射链脲佐菌素60 mg/kg (0.60 ml/100g)诱导糖尿病大鼠模型,血糖≥16.7mmol/L为造模成功,对照组以同样的方法注射等容量柠檬酸钠缓冲液。(2)建模成功的糖尿病大鼠定期检测血糖和测量体重,并记录。于模型建立后8w处死大鼠并提取视网膜组织,采用免疫荧光法和Western blot法分别从形态学和分子生物学水平观察及检测visfatin和VEGF在视网膜中的表达情况。结果 (1)造模后8w糖尿病组大鼠平均体质量为(189±11)g,明显低于对照组的(489±14)g,差异有统计学意义(t=5.236,P=0.003)；造模后8w糖尿病大鼠血糖水平为(29.25±3.86)mmol/L,明显高于对照组的(5.32±1.01)mmol/L,差异有统计学意义(t=11.778,P=0.000)。(2)免疫荧光双标法检测显示,对照组大鼠视网膜中visfatin和VEGF主要在视网膜神经纤维层和星形胶质细胞呈中少量表达,但在早期糖尿病大鼠视网膜全层中可见visfatin及VEGF强阳性染色,且二者呈共表达。(3)Western blot检测显示,造模后8w糖尿病大鼠视网膜中visfatin表达水平(A值)为346.26±41.23,对照组为102.07±65.01,差异有统计学意义(t=8.291,P=0.000)；造模后8w糖尿病组大鼠视网膜中VEGF蛋白表达量(A值)为415.88±92.15,明显高于对照组大鼠的113.06±32.06,差异有统计学意义(t=10.067,P=0.000)。结论早期糖尿病大鼠视网膜中visfatin呈高表达,提示visfatin在糖尿病视网膜病变发生发展过程中可能起关键作用,其机制可能与局部高糖低氧诱导Mtiller细胞分泌产生,进而上调VEGF的表达所致。