目的：研究Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶Sirtl对转录因子AP-1(activator protein-1)的转录抑制作用,及Sirtl通过AP-1抑制COX-2 (cyclooxygenase-2)的表达,下调巨噬细胞炎症反应,改善巨噬细胞的功能及其机制。背景：Sirt1是酵母染色质沉默因子(Silent information regulator 2, Sir2)的哺乳动物同源体,属于Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶。Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶参与的反应依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamid adenine dinecleotide, NAD+),这不同于Ⅰ类和Ⅱ类组蛋白去乙酰化酶。Sir2家族的蛋白从细菌到人类都具有高度保守性,人Sirtuins是与Sir2具有同源性的一个家族,其中Sirt1是与Sir2同源性最高的一个成员,在许多生命过程,如细胞凋亡、细胞周期、DNA损伤修复、重组、长寿和基因沉默中都发挥了重要的作用。近年来的研究表明,Sirt1不仅可以去乙酰化组蛋白如组蛋白H3、H4等,而且与很多转录因子和转录辅因子相互作用,调节它们的转录激活作用。这些转录因子包括：p53、FOXO家族、NF-KB(p65)、MyoD等；转录辅因子包括：NcoR、p300、PGC-1α等。转录因子AP-1是由结构功能相关的亚家族亚单位组成的二聚体。这些成员均有进化保守的亮氨酸拉链(leucine zipper)又称碱性拉链(bZIP)结构域。c-Fos和c-Jun是哺乳动物细胞内最为常见的两种AP-1亚单位。AP-1对细胞因子、生长因子、感染及致癌刺激等生理或病理信号发生应答,通过bZIP结构域的碱性区域与DNA序列结合,调节基因的转录,参与细胞的增殖、分化等过程。AP-1的活性调节是通过多方面来完成的,包括转录调节、翻译后修饰、AP-1分子的二聚化及和其他辅助蛋白的相互作用调节。COX-2是研究最为深入的AP-1下游分子之一,在巨噬细胞中,COX-2的活性参与炎症反应和巨噬细胞功能调节。材料和方法：本实验首先在HEK293细胞中通过荧光素酶报告基因实验方法检测了Sirt1在基础水平和PMA处理下对AP-1的转录活性的影响。随后通过免疫共沉淀的方法确定了Sirt1和c-Fos、c-Jun相互作用的具体结构域。应用EMSA的方法,检测了Sirt1对AP-1的DNA结合活性的影响。通过荧光素酶报告基因实验ChIP、Western blotting及PGE2测定等检测Sirt1对AP-1下游基因COX-2表达及功能的影响。用K562和Jurkat细胞作为目标细胞,检测巨噬细胞的肿瘤杀伤活性；用FITC标记酵母作为吞噬物来检测Sirt1对巨噬细胞吞噬功能的影响。随后制备能量限制小鼠模型,模拟Sirt1高表达状态,检测巨噬细胞COX-2的表达、活性及巨噬细胞功能。结果：本研究发现Sirt1可以抑制基础水平和PMA诱导的AP-1的转录激活作用。AP-1家族中最广泛表达的c-Fos, c-Jun可以和Sirt1相互作用。进一步研究确定了c-Fos、c-Jun碱性DNA结合区参与介导了与Sirt1的相互作用。Sirt1抑制了c-Fos、c-Jun的乙酰化水平,并且抑制了AP-1的DNA结合能力。实验表明Sirt1抑制了AP-1的下游基因COX-2启动子活性。在巨噬细胞中,腺病毒介导的Sirt1高表达下调的COX-2的蛋白水平和COX-2的产物PGE2的生成。进一步的功能学实验表明,Sirt1对巨噬细胞的肿瘤杀伤能力和吞噬能力具有增强和保护作用,这可能是通过抑制COX-2活性来实现的。能量限制小鼠腹腔巨噬细胞Sirt1表达上调。与同窝正常饮食小鼠相比,能量限制小鼠巨噬细胞COX-2表达降低,肿瘤杀伤和吞噬功能增强,模拟了Sirt1过表达的实验效果,从另一方面证明Sirt1的作用。进一步研究发现PMA可以诱导巨噬细胞内Sirt1的表达,这可能是一种细胞的负反馈保护机制,从而防止细胞在某些刺激作用下炎症反应过于激烈,对细胞造成不可逆的损伤,从而保护细胞功能状态。结论：我们首次发现AP-1可能是Sirt1的一个新的底物分子。Sirt1可以通过和c-Fos、c-Jun结合并降低c-Fos、c-Jun乙酰化水平,抑制AP-1与DNA的结合,从而进一步抑制其转录激活。在巨噬细胞内,Sirt1可能通过抑制AP-1降低了COX-2的表达及活性,从而抑制了炎症反应,保护了巨噬细胞的肿瘤杀伤和吞噬能力。因此,提高Sirt1的表达和活性可以作为一个调节炎症及免疫反应,保护机体的新的手段。