目的:通过体外实验,研究肺积宁方含药血清对Lewis肺癌细胞增殖和凋亡的影响,并检测与凋亡密切相关的自噬基因Beclin1、LC3B-Ⅱ、LC3B-Ⅰ、Atg5蛋白水平表达及RNA水平的影响,探讨肺积宁方的抗癌作用及其对自噬的关系;并通过体内实验,运用裸鼠lewis移植瘤模型,分析肺积宁方在体内代谢后抗癌效果,观察其对Lewis肺癌细胞形态学影响、对自噬相关基因Beclin1、LC3B-Ⅱ、LC3B-Ⅰ、Atg5蛋白表达的影响。最终通过体内体外实验,了解肺积宁方对Lewis肺癌细胞抗癌效果及其作用机制。材料与方法:体外实验:制备含药血清,作用于Lewis肺癌细胞。40只大鼠按随机数字表法分为肺积宁方高剂量组、肺积宁方大剂量组、肺积宁方中剂量组、肺积宁方低剂量组和对照组。各组动物分别给予高、大、中、低剂量组肺积宁方及等量生理盐水灌胃,每天1次,连续3天,第3天晚上禁食不禁水12h,次日断头取血;用铡刀断头取血,制备肺积宁方含药血清。MTT法检测肺积宁方含药血清对Lewis肺癌细胞的增殖抑制效应,分为肺积宁方含药血清高剂量组、含药血清大剂量组、含药血清中剂量组、含药血清低剂量组和对照血清组。同时设置不加细胞的空白孔。分别加不同浓度肺积宁方含药血清及正常对照组含药血清,分别于培养24 h、48 h、72h收集细胞进行MTT检测,观察肺积宁方含药血清抑制Lewis肺癌细胞增殖的最佳药量和作用时间,筛选出最佳含药血清剂量组,进行后续实验;流式细胞术检测对照组,肺积宁方组,顺铂组,联合组作用48h,细胞凋亡率。GFP-LC3转染定位法检测各组细胞自噬情况:将Lewis细胞以6×105细胞/孔的密度接种于6孔板,分为4组,对照组每孔加入含20%对照组血清DMEM培养液、肺积宁方组为20%肺积宁方含药血清DMEM培养液、顺铂(1μg/ml)组、联合组(20%肺积宁方含药血清+顺铂1μg/ml)。将GFP-LC3转染后的Lewis肺癌细胞正常培养条件下培养24 h,对照组加对照血清、肺积宁方组加肺积宁方含药血清、顺铂组加顺铂、联合组加顺铂和肺积宁方含药血清。正常培养24h,荧光显微镜下观察,调整显微镜发射波长395nm,激发滤色镜的波长509nm,拍照,计数。免疫印迹法检测Beclin1蛋白、Atg5和LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ的比例来判断自噬是否被诱导,对照组每孔加入含20%对照组血清DMEM培养液、肺积宁方组为20%肺积宁方含药血清DMEM培养液、顺铂组为顺铂(1μg/ml)组、联合组(20%肺积宁方含药血清+顺铂1μg/ml),培养48h,收集细胞。免疫印迹的定量,用Bio-Rad提供的分析软件进行灰度分析。计算Beclin1、LC3B-I、LC3BII、Ag5和内参照β-actin比值,评价自噬情况。real time PCR检测Beclin1、LC3B-Ⅱ、Atg5的m RNA表达。体内实验:建立裸鼠荷瘤模型,Lewis瘤株,液氮保存,于37℃,水浴中复苏,放入37℃、5%C02细胞培养箱中,台盼蓝染色观察记录活细胞数(>95%),调整细胞浓度至1x107/m1的瘤细胞悬液,碘伏消毒,使用1ml注射器,在每只小鼠右腋窝皮下接种瘤细胞0.2ml,共接种50只。一般状态及自主活动次数观察:每日观察精神、饮食、活动、大小便等一般情况,每隔两日称小鼠体重,分别于用药前、d8、d17检测小鼠活动,于每天的同一时刻,小鼠自主活动测试仪测小鼠平行移动和站立次数,计算出每组裸鼠每分钟自主活动次数。实验结束,剥离瘤体,称瘤重及抑瘤率:抑瘤率=(对照组平均瘤重一实验组平均瘤重)/对照组平均瘤重x100%,肿瘤组织病理形态学观察,各组瘤组织,包埋,完成石蜡组织块制作,用显微镜观察染色结果:细胞核呈现鲜艳的蓝色,细胞质及细胞间质呈粉红至红色。透射电镜观察瘤组织细胞的自噬小体,将取下的瘤组织快速切成1mm3大小,固定,超薄(70nm)切片,铀、铅双重染色,电镜下观察瘤组织细胞中的自噬小体,照相、记录。Western blotting检测瘤组织中Beclin1、LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ、Atg5的蛋白表达。结果:1.肺积宁方含药血清对Lewis肺癌细胞增殖的影响肺积宁方含药血清对Lewis肺癌细胞的增殖有显著抑制作用,同一时间随着浓度的增加或者同一种浓度随着时间的延长其抑瘤作用增强(P<0.01)。分别在24h,48h,72h检测对lewis细胞的抑制作用,结果发现和对照组相比,肺积宁方含药血清抑制Lewis细胞的增殖,且抑制效果随着浓度、时间的增加而增强。中剂量组抑制率在24h、48h时相抑制率分别为19±1.84%,24±1.93%,与对照组的15±1.08%,20±2.06%比较,均有统计学显著差异(P<0.05),并且其抑制效果有随着浓度增加和时间延长而增强的趋势。大剂量组的抑制率分别为28±2.03%、32±2.04%,与中计量组比较有明显增加(P<0.05)。高剂量组在各个时相的抑制率与大剂量组比较,均无统计学意义。其最佳含药血清剂量组为大剂量组,进行后续实验。2.肺积宁方含药血清与顺铂联合对Lewis肺癌细胞增殖的抑制作用,肺积宁方组在不同作用时间,第24h、48h、72h抑制率分别为28%、32%、33%;顺铂组42%、66%、75%;联合组为58%、86%、91%。3.流式细胞仪检测流式细胞术检测对照组,肺积宁方组,顺铂组,联合组作用48h,细胞凋亡率,对照组、肺积宁方组、顺铂组及联合组对Lewsi肺癌细胞作用48h后的凋亡率分别为3.20%、10.36%、18.31%、30.18%,凋亡率以联合组作用为最高。与对照组比较,肺积宁方组促进凋亡作用明显,P<0.01;与顺铂组比,联合组明显提高了凋亡比例,统计学差异显著,P<0.01。处于G0/G1期,肺积宁方组处于此周期细胞较多比例为38.69%,顺铂组为56.12%,联合组最高,68.35%。4.自噬GFP-LC3转染及计数结果显示,对照组细胞中GFP-LC3融合蛋白弥散在包浆中,但代表自噬体的荧光斑点很少观察到;肺积宁方组有较为明显的绿色荧光聚集,可以观察到自噬体形成,荧光的强度比对照组明显高亮。经肺积宁方含药血清处理的,大多数细胞发生自噬(37.5%),而对照组自噬率较低(17.6%),具有显著差异,P<0.05。与顺铂组的自噬率(56.4%)相比,联合组的荧光斑点也明显增多,自噬发生率77.9%,并进行统计分析,两组差异明显,P<0.05。5.Western blotting检测Beclin1、LC3B-Ⅱ/LC3B-I、Atg5的变化免疫印迹法检测结果显示:肺积宁组较对照组Beclin1、Atg5蛋白表达显著增强,灰度值分别为Beclin1(0.38 VS 0.24),Atg5(0.31 VS 0.18)。LC3B-Ⅱ/LC3B-I灰度值比值(0.52 VS 0.2),差异显著,P<0.05。联合组与顺铂组比较,Beclin1(0.62 VS0.44)、Atg5(0.63 VS 0.41)也表达增强,LC3B-Ⅱ/LC3B-I灰度值比值上升(0.98 VS0.81),均有显著差异(P<0.05)。6.real time PCR检测Beclin1、LC3B-Ⅱ、Atg5的m RNA表达引物验证,各引物扩增曲线均正常,溶解曲线无杂峰,均单峰,平均溶解温度一致,具有特异性。real time PCR结果提示,肺积宁方组细胞中的Beclin1、LC3B-Ⅱ、Ag5的m RNA表达增强,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05);联合组细胞的Beclin1、LC3B-Ⅱ、Ag5的m RNA表达也明显高于顺铂组,差异显著(<0.05)。7.裸鼠成瘤情况、一般状态;各组药物对肿瘤生长的影响各组裸鼠瘤体大小较为相似、均衡。在平均肿瘤体积长到100mm3时,给药。B组(肺积宁方低剂量组)和C组(高剂量组)体重增长较为稳定,高低剂量组相差不大,精神及活动保持较好;A组(对照组)早期体重变化不明显,d10开始略有下降;D组(顺铂组)在给药3天后体重下降明显,精神萎靡,活动差;E组体重下降,与D组相比较下降较缓,但比B组和C组明显,后期下降不明现,精神和活动状态较D组表现好。B组和C组(单用肺积宁方组)自主活动次数较A组活跃,B组和C组比较,差异不显著;E组与D组比较,自主活动次数明显有优势。8.肺积宁方对裸鼠Lewis移植肿瘤生长的影响:B组、C组、D组和E组的肿瘤重量均低于对照组,与对照组比较有显著差异(p=0.000﹤0.01),B组瘤重较C组要轻,但差异不显著;其中E组的瘤重最轻,明显低于单独用药组(p﹤0.01),D组的瘤重组低于B组和C组,有统计学差异(p=0.031﹤0.05)。B组、C组、D和E组的抑瘤率分别为33.7%、40.6%、56.6%、66.9%,说明肺积宁方对Lewis移植肿瘤的生长有抑制作用,并与顺铂有协同作用。9.各组裸鼠移植瘤HE染色结果:肉眼瘤组织,较为规整,剥离较容易。部分瘤体的外区域可见坏死。HE染色光镜下可见,A组肿瘤细胞大,排列较为杂乱,紧密,核大深染,核浆比例失衡,处于分裂象细胞较多;B组及C组,肿瘤细胞大小较稍规整,可见坏死细胞明显较多,异型性较少见;D组可见大量坏死,可见少量纤维组织;E组坏死细胞大量出现,肿瘤细胞较小,分裂象比较少见,且周围有大量的淋巴细胞,白细胞浸润。10.各组裸鼠移植瘤电镜透视观察自噬小体各组均可见双层膜包裹的自噬体,可见典型的凋亡小体,其由膜包绕,小体内可见核的残片及细胞器。其中B组和C组可见较多散在的自噬体,D组也可见胞质内大量空泡,E组最为多见。依次增多:A组、B组、C组、D组、E组。11.Westen blot检测瘤组织中自噬相关蛋白Beclin1、LC3B-Ⅱ、Atg5表达水平。采用Western blot蛋白免疫印迹法,检测各组裸鼠抑制瘤组织中自噬相关基因Beclin1、LC3B-Ⅱ、Atg5的蛋白表达水平。Beclin1、LC3B-Ⅱ、Atg5蛋白相对灰度值,B组分别为0.63、0.46、0.82,和C组的0.65、0.48、1.0比较无差异,P>0.05;B、C两组与A组0.42、0.38、0.43比较,显著增高,P<0.05;Beclin1、LC3B-Ⅱ、Atg5蛋白相对灰度值在E组的统计值0.80、0.78、1.3,显著高于D组0.78、0.62、1.0,P<0.05。结论:1.肺积宁方含药血清能抑制Lewis肺癌细胞增殖,并能促进其凋亡。2.肺积宁方含药血清诱导Lewis肺癌细胞自噬,增强Beclin1、LC3B-Ⅱ、Atg5蛋白和m RNA水平的表达,提高LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比例。3.肺积宁方能改善荷瘤裸鼠的一般状态、增加自主活动次数,抑制荷瘤裸鼠的肿瘤生长。4.肺积宁方上调荷瘤裸鼠瘤组织中Beclin1、LC3BB-Ⅱ、Atg5蛋白的表达,提高LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比例。5.肺积宁方具有抑制肿瘤作用,可能与诱导自噬有关。