目的:　　胃癌是世界上常见的恶性肿瘤之一，其发病率居世界第四位，死亡率居世界第二位，大部分胃癌确诊时已为进展期，失去了手术的机会，5年生存率不到10％。目前化疗仍是进展期胃癌的主要治疗手段，但化疗的有效率低。尽管联合化疗使晚期病人的生存期有所延长，但中位生存期仍不超过12个月，因此寻找更有效的治疗方案、改变现有的用药策略是重要的研究方向。近年来，分子靶向治疗成为抗肿瘤治疗的新方向。目前，分子靶向治疗在大肠癌、肺癌、乳腺癌等肿瘤中取得了许多较好的研究结果。但胃癌靶向药物治疗相对滞后，近年来，研究显示靶向药物治疗过程中存在着耐药，从而减弱了靶向药物的疗效。目前寻找联合治疗方案、逆转耐药、从而增强疗效成为研究热点。　　哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白，它主要通过PI3K/Akt/mTOR途径参与肿瘤细胞增殖、细胞周期、蛋白合成、细胞迁移等多个过程。雷帕霉素（rapamycin）是最早被发现的mTOR抑制剂，具有免疫抑制、抗肿瘤和抗菌作用。尽管雷帕霉素及其衍生物在胃癌体内及体外的一些试验中显示出较好的抗肿瘤活性，但也有研究显示部分胃癌细胞对其耐药。最近的Ⅲ期临床试验显示单用mTOR抑制剂与系统性化疗相比，并没有提高进展期胃癌患者的生存期。目前研究显示mTOR抑制剂应用过程中可能存在一些耐药机制，从而影响了mTOR抑制剂的疗效。其耐药机制包括:PI3K/Akt信号通路的过度激活，FKBP-12、mTOR突变，MAPK/ERK通路活化，PIM激酶的激活等。最近一项研究显示抑制Akt信号通路可逆雷帕霉素耐药、增加乳腺癌对雷帕霉素的敏感性，但在胃癌细胞中PI3K/Akt信号通路的过度激活是否参与雷帕霉素耐药尚不清楚。　　近期有两项研究发现，在恶性黑色素瘤及骨肉瘤中塞来昔布联合雷帕霉素有叠加效应，但其作用机制尚不清楚。塞来昔布(Celecoxib)是一种高选择性的COX-2抑制剂，其能通过阻滞肿瘤细胞周期、抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞调亡、阻断肿瘤介导的免疫抑制表达、抑制肿瘤新血管生成等起到抗肿瘤作用。近期研究发现塞来昔布可通过抑制PI3K/Akt信号通路增强EGFR-TKI对肺癌的敏感性、增强TRAIL对肠癌的敏感性。塞来昔布是否能增强胃癌细胞对雷帕霉素的敏感性，同时塞来昔布是否通过抑制PI3K/Akt信号通路发挥作用尚不清楚。本研究试在探索:塞来昔布是否能增强胃癌细胞对雷帕霉素的敏感性及其机制。　　塞来昔布对PI3K/Akt的调控为其发挥抗肿瘤作用的主要机制之一，但塞来昔布如何调控PI3K/Akt，目前确切机制尚不清楚。Cbl-b是E3泛素连接酶功能，可通过特异性地选择底物蛋白，启动泛素化降解途径，参与信号转导的负性调控。研究发现Cbl-b可通过泛素化PI3K的P85亚单位，从而使PI3K失去功能，信号不能下传，无法激活下游的Akt。Cbl-b是否参与塞来昔布对PI3K/Akt的负性调控尚不清楚。　　本研究以胃癌MGC803、SGC7901细胞为模型，明确塞来昔布联合雷帕霉素对胃癌细胞增殖抑制的影响，进而探讨PI3K/Akt通路及其上游分子泛素连接酶Cbl-b蛋白在其过程中的调控机制。　　材料与方法:　　1、采用MTT法测定细胞活力　　2、采用集落形成实验观察细胞增殖能力　　3、采用Western blot检测mTOR、Akt、ERK、p70S6K、Cbl-b、Actin　　4、采用Lipofectamine2000试剂进行瞬时转染　　5、统计学处理:每次实验重复3次，数据以(x)±s表示，两组间差异采用Studentst test分析。P＜0.05有统计学意义。　　实验结果:　　1、不同浓度的雷帕霉素作用于MGC803、SGC7901两种胃癌细胞72h后，MTT结果显示，雷帕霉素对两种细胞的抑制率分别为26.09％±2.35％、29.08％±4.43％，提示这两种胃癌细胞系对雷帕霉素耐药。为了进一步研究雷帕霉素对MGC803、SGC7901两种胃癌细胞的耐药机制，应用雷帕霉素100nM作用于MGC803、SGC7901两种胃癌细胞72h，应用Western blot检测PI3K/Akt信号通路变化情况，显示雷帕霉素作用于这两种细胞后p-Akt出现明显上调。用LY294002（PI3K特异性抑制剂）抑制Akt信号通路的活性后，能逆转细胞对雷帕霉素的耐药，其抑制率分别为(47.17％±3.00％ vs15.70％±2.97％，P＜0.01;49.57％±2.92％ vs20.22％±2.84％, P＜0.001)。　　2、为了明确塞来昔布对胃癌细胞增殖影响，不同浓度的塞来昔布作用于COX-2低表达的MGC803及COX-2高表达的SGC7901两种细胞系72h，MTT结果显示，塞来昔布以剂量依赖性的方式抑制胃癌细胞增殖，抑制细胞50％的药物浓度(IC50)分别为47.25±6.43μM、43.53±5.12μM。塞来昔布对COX-2低表达的MGC803细胞也有明显的抑制增殖作用，提示塞来昔布至少部分通过COX-2非依赖途径发挥作用。　　为了研究塞来昔布能否增强胃癌细胞对雷帕霉素的敏感性，40μM塞来昔布联合100nM雷帕霉素作用于MGC803、SGC7901细胞72h，MTT结果显示，塞来昔布明显提高了雷帕霉素对这两种胃癌细胞的敏感性，其抑制率分别为(53.92％±4.31％vs18.66％±3.18％，P＜0.001;60.74％±4.68％vs21.16％±2.88％,P＜0.01)。提示塞来昔布能增强胃癌细胞对雷帕霉素的敏感性。应用集落形成实验进一步验证了塞来昔布增强雷帕霉素对胃癌细胞的敏感性。10μM LY294002、30μM塞来昔布单独或联合100nM雷帕霉素作用于MGC803、SGC7901胃癌细胞14天，显示LY294002、塞来昔布明显增强了胃癌细胞对雷帕霉素的敏感性。进一步Western blot结果显示，雷帕霉素作用于MGC803、SGC7901这两种胃癌细胞24h后，p-mTOR、p-p70S6K表达水平明显减低，但与此同时p-Akt表达水平明显升高，当联合塞来昔布作用后，雷帕霉素引起的p-Akt升高均能明显被抑制，显示在胃癌细胞中塞来昔布联合雷帕霉素可有效的抑制PI3K/Akt/mTOR/p70S6K信号通路。　　3、为了研究塞来昔布对Akt活性的抑制是否与Cbl-b有关，我们研究发现塞来昔布作用于MGC803、SGC7901这两种胃癌细胞后，Cbl-b表达水平明显升高，塞来昔布联合雷帕霉素作用后Cbl-b升高程度与单药塞来昔布相似。而单用雷帕霉素并不影响Cbl-b的表达。这些结果提示塞来昔布对Akt的调控可能与Cbl-b有关。　　为了进一步验证Cbl-b是否参与了塞来昔布对Akt的负性调控，塞来昔布联合雷帕霉素作用于“沉默”了Cbl-b的MGC803、SGC7901这两种胃癌细胞，Westernblot的结果显示，与对照组相比，塞来昔布单药组及塞来昔布联合雷帕霉素组对Akt活性的抑制作用明显减弱。MTT结果显示，与对照组相比，塞来昔布联合雷帕霉素对这两种细胞的增殖抑制影响明显降低（26.01％±1.70％ vs51.61％±3.71％，P＜0.05;36.69％±2.82％ vs55.89％±4.67％，P＜0.05）。这些结果表明Cbl-b参与了塞来昔布对PI3K/Akt的负性调控。　　结论:　　1、胃癌细胞MGC803、SGC7901对雷帕霉素耐药，PI3K/Akt信号活化参与了胃癌细胞对雷帕霉素的耐药。　　2、塞来昔布通过抑制PI3K/Akt信号通路增强MGC803、SGC7901两种胃癌细胞对雷帕霉素的敏感性。　　3、塞来昔布在抑制胃癌细胞MGC803、SGC7901增殖过程中上调了Cbl-b的表达;Cbl-b通过负性调节PI3K/Akt信号通路参与塞来昔布增强胃癌细胞对雷帕霉素的敏感性。