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性腺的分化和发育是动物生长发育的一个重要过程。其中,睾丸的发育是雄性个体发育成熟、维持正常生殖生理活动的重要基础。许多在不同水平具有性别偏向性的因子构成复杂的调控网络,在性腺发育中起着重要调控作用。在鸡中,关于分化为睾丸或卵巢的性腺发育分子调控过程和机制的资料较少,还有待于进一步深入研究。本课题组在前期研究中筛选出了具有雄性偏向性的miRNA-2954,并验证了FOXD1和YY1是它的两个靶基因。基于以上基础,本研究进一步在鸡中分析FOXD1基因在睾丸中的的表达谱和组织、细胞定位,并在支持细胞中分析miRNA-2954与靶基因FOXD1和YY1、以及下游与睾丸发育相关的基因的调控关系,研究miRNA-2954是否通过两个靶基因来调控睾丸的发育。本研究成果如下:1.通过定量PCR在成年雌雄鸡6种组织和不同胚胎期雌雄性腺中构建FOXD1的组织和时间表达谱,确认了FOXD1在成年鸡大脑、肾脏、性腺和鸡胚早期E6.5、E12.5、E18.5性腺中的雄性高表达模式。2.E6.5-18.5的睾丸组织切片的免疫组化和免疫荧光结果均表明FOXD1在鸡睾丸支持细胞中表达;且免疫荧光结果显示其表达与鸡睾丸支持细胞特异表达标记基因SOX9相同。鸡睾丸支持细胞爬片的免疫组化、免疫荧光显示FOXD1主要在支持细胞核中表达。3.在本实验室成功建立了完善的鸡睾丸原代支持细胞培养体系:采用胰酶/胶原酶二步消化法制备鸡睾丸原代支持细胞,并实现了原代支持细胞的传代、转染、冻存;通过油红O染色法鉴定了原代支持细胞的细胞质中含有大量脂肪颗粒的特征。4.在鸡睾丸支持细胞中成功进行miRNA-2954的超表达和抑制试验,并通过定量PCR检测转染后细胞中靶基因YY1和FOXD1及DMRT1、SOX9、AMH、AR等睾丸相关基因的表达情况,结果表明miRNA-2954抑制这些基因的表达,与前期DF-1细胞中靶基因抑制结果一致。5.在鸡睾丸支持细胞中进行FOXD1、YY1的siRNA干扰,然后利用定量PCR检测转染后睾丸发育相关基因的表达,除了DMRT1不受FOXD1调控,FOXD1抑制后的其他相关基因表达的结果与miRNA-2954超表达的结果一致;而YY1的抑制引起DMRT1、SOX9、AMH的上调,初步表明YY1的抑制可能对miRNA-2954有负反馈调节作用。以上结果揭示了靶基因FOXD1在鸡睾丸发育中的重要作用,在鸡睾丸支持细胞中确定了miRNA-2954对靶基因FOXD1、YY1的抑制作用,通过靶基因的干扰说明了miRNA-2954通过介导靶基因FOXD1、YY1来调控下游睾丸发育相关基因的表达,同时也可能受到YY1的反馈调节以维持稳态。