拟态弧菌是一种食源性致病菌,可污染鱼虾蟹贝类等水产品。拟态弧菌可产生黏附素、肠毒素和溶血素等毒力因子,导致机体发病。生物膜是由细菌和自身分泌的多糖、蛋白质、DNA等胞外基质组成的结构。拟态弧菌具有较强的生物膜形成能力,生物膜的存在增加了拟态弧菌污染的风险。表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是茶多酚中最有效的活性成分,对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有显著的抑菌效果。近年来,EGCG广泛应用于牙齿保健和食品保鲜等领域,但EGCG对拟态弧菌的抑制作用尚未见报道。因此,本文以一株鱼源分离株拟态弧菌SNJ为研究对象,研究EGCG对该菌生物膜和毒力的抑制作用,并通过研究EGCG对拟态弧菌细胞膜特性的影响,初步阐明其作用机制。本文主要研究结果如下:1、拟态弧菌SNJ鉴定与产膜特性分析。从鲢鱼中分离得到一株细菌SNJ,通过形态观察、生理生化试验和16SrDNA序列分析对其进行鉴定,结果显示该菌为拟态弧菌。将拟态弧菌SNJ接种到不同的培养基中28℃C培养5 d,每隔24 h结晶紫染色法测定生物膜量。结果显示,拟态弧菌SNJ在LB、BHI、NB、TSB、1/2LB、MH培养基中均能产膜,在LB培养基中静置培养3d产膜量最大。拟态弧菌SNJ生物膜组成成分测定结果表明,拟态弧菌SNJ生物膜胞外基质含有蛋白质、多糖和DNA,蛋白质占生物膜干重的4.295%,多糖占0.441%,DNA占0.04%。2、亚抑菌浓度的EGCG抑制拟态弧菌SNJ生物膜形成。通过微量稀释法测得EGCG对拟态弧菌SNJ最低抑菌浓度(MIC)为256 μg/mL。拟态弧菌SNJ在聚苯乙烯微量滴定板上15℃C下培养11 d、28℃下培养6 d、37℃C培养5 d,每隔24 h测定生物膜量。结晶紫染色法测定结果显示,亚抑菌浓度(64 μg/mL、128μg/mL)和最低抑菌浓度(256μg/mL)的EGCG能显著抑制生物膜的形成。拟态弧菌SNJ接种到含EGCG的0.3%软琼脂培养基上,15℃下培养72 h、28℃下培养24 h、37℃培养20 h。亚抑菌浓度(64 μg/mL、128μg/mL)和最低抑菌浓度(256 μg/mL)的EGCG均能显著抑制拟态弧菌SNJ泳动能力。拟态弧菌SNJ接种到含EGCG的0.5%琼脂培养基上,28℃下培养24 h。亚抑菌浓度(64 μg/mL、128 μg/mL)的EGCG对拟态弧菌群集运动无影响。拟态弧菌SNJ接种到八孔腔式载玻片,加入EGCG后在37℃下共培养3d,PI和FITC-ConA对生物膜双染后,激光共聚焦显微镜观察生物膜结构。结果显示:亚抑菌浓度(32 μg/mL)的EGCG能抑制生物膜形成,减少生物膜的厚度。3、亚抑菌浓度的EGCG抑制拟态弧菌SNJ毒力。PCR扩增拟态弧菌SNJ肠毒素基因ctx、st、zot和溶血素基因vmh,结果显示,拟态弧菌SNJ不含肠毒素基因,但具有溶血素基因。拟态弧菌SNJ接种到加有EGCG的培养基37℃振荡共培养24小时,离心洗涤菌体后加入多粘菌素B处理,离心取上清作为试样,诱导小鼠巨噬细RAW264.7细胞凋亡。结果显示,与不加EGCG的拟态弧菌相比,EGCG(64μg/mL、256μg/mL)处理的拟态弧菌诱导小鼠巨噬细胞凋亡率明显降低,表明亚抑菌浓度EGCG可降低拟态弧菌SNJ毒力。4、EGCG对拟态弧菌SNJ氧化应激的影响。不同浓度EGCG与拟态弧菌SNJ 37℃C共培养2h后,测定细菌胞内活性氧(ROS)、过氧化氢(H2O2)和超氧化物歧化酶(SOD)。结果显示低浓度EGCG(64 μg/mL、128 μg/mL、256μg/mL)和高浓度EGCG(512 μg/mL)可以诱导拟态弧菌SNJ胞内ROS和H2O2水平显著升高,但显著抑制胞内SOD活性,激活拟态弧菌SNJ氧化应激反应。5、EGCG对拟态弧菌SNJ细胞膜的影响。不同浓度EGCG与拟态弧SNJ 37℃C共培养2 h后,分别用PI和DBAC4(3)单染后流式细胞仪检测。结果显示64μg/mL、128 μg/mL、256 μg/mL的EGCG可破坏细胞膜完整性,改变细胞膜膜电位。分别用NPN和ONPG检测细胞外膜和细胞内膜渗透性的变化,结果显示:1MIC的EGCG使拟态弧菌SNJ细胞内膜渗透性增大。综上所述,本文发现亚抑菌浓度的EGCG可以显著抑制拟态弧菌SNJ生物膜形成以及降低其毒力。EGCG可能通过氧化应激破坏细胞膜结构,改变外膜与肽聚糖的交联状态,进而改变外膜小泡的分泌,导致拟态弧菌SNJ生物膜形成和毒力受抑制。这些结果表明EGCG可作为一种天然防腐剂用于食品保鲜,可有效防控拟态弧菌造成的污染,但其抑制拟态弧菌SNJ毒力和生物膜形成的机理仍未完全阐释清楚,还需要深入研究。