研究背景子痫前期(preeclampsia,简称PE)是妊娠期特有的全身性疾病。鉴于子痫前期的高发病率、高致死率及远期的危害,对子痫前期发病机制及相应治疗方案的研究,寻找有效的治疗靶点,成为妇产科领域内一大热点和难点问题。迄今为止,人们对子痫前期的发病机制进行了大量的研究,并提出了多种学说,如免疫失衡学说、氧化应激学说、胎盘浅着床等。此外,其它因素如胰岛素抵抗,遗传因素、营养缺乏等均可影响子痫前期的发病。但目前仍无单一的理论能完全解释子痫前期的病因及发病机制,因此仍需对其进行进一步的探索。目前研究认为,子痫前期是一种胎盘源性疾病。滋养细胞侵入不足,从而导致子宫螺旋动脉重铸障碍是该疾病的病理基础。因此,探索滋养细胞功能的影响因素及机制对丰富子痫前期发病机制具有积极的意义。近期,Cuietal.等的一项动物实验发现,心钠素(atrial natriuretic peptide,ANP)在小鼠滋养细胞侵入和子宫螺旋动脉重铸过程中具有重要的作用。该研究发现,ANP基因敲除小鼠在妊娠后出现了子痫前期的临床症状及胎盘的病理改变:滋养细胞浸润较野生型小鼠延迟、子宫螺旋动脉重铸异常——管腔小,管壁仍存在血管内皮细胞和数层平滑肌细胞。体外实验发现,ANP可能通过与NPR-A受体作用促进人滋养细胞株BeWo细胞和人胎盘滋养细胞的侵袭,提示ANP及其受体NPR-A在调节滋养细胞功能上具有重要的作用。既往研究发现,人类胎盘及蜕膜组织中均有ANP及其受体NPR-A的mRNA的表达;且与正常妊娠胎盘相比,子痫前期胎盘中ANP与其受体的亲和力显著降低。上述研究结果提示,ANP及其受体在人类妊娠中可能发挥着重要的作用,而ANP和/或其受体的异常可能与子痫前期的发病密切相关。然而目前ANP及其受体NPR-A在胎盘及蜕膜组织中的表达及定位仍未完全明确、ANP及其受体NPR-A是否通过影响滋养细胞的功能从而参与子痫前期的发病仍未见文献报道。氧化应激是目前公认的子痫前期发病的重要机制之一。氧化应激指的是细胞暴露于高浓度的O2或化学衍生物即活性氧(reactive oxygen species,ROS)而引起的细胞损伤。而缺氧是氧化应激的诱发因素之一。子痫前期胎盘中存在着明显的氧化应激现象——子痫前期胎盘中ROS水平显著升高、蛋白质和脂质过氧化物、DNA碎片等氧化应激产物显著增多。体外细胞实验表明,缺氧、氧化应激产物可以诱导细胞内ROS生成增多,促进滋养细胞凋亡,进而影响胎盘着床。在正常妊娠过程中,胎盘不断生成ROS及氧化应激产物——胚胎着床后,滋养细胞侵入并闭锁了母体子宫螺旋动脉,母体流入胎盘的血液减少。因此,胎盘在发育的早期是处于一种低氧环境之中,而缺氧环境可以使细胞及组织内蓄积大量的电子及超氧化物。当母体与胎盘之间的血液循环完全建立,胎盘内氧气浓度会迅速增,胎盘内ROS的生成随之进一步增加。而妊娠过程中,胎盘组织中抗氧化能力不断提高,如过氧化氢酶、谷胱甘肽氧化酶及超氧化物趋化酶的增多及活性增高,使得胎盘免受ROS对组织、细胞的损伤。当胎盘抗氧化能力降低,滋养细胞过度凋亡,胎盘功能出现异常。大量研究表明,子痫前期患者胎盘中抗氧化能力降低,如抑制ROS生成的酶类如超氧化物歧化酶SOD等以及一些抗氧化物质如谷胱甘肽等表达降低;因此有学者指出,妊娠期胎盘抗氧化能力降低参与了子痫前期的发病过程。对心肌及肝脏的研究发现,ANP可以抑制H202、内皮素、血管紧张素Ⅱ诱发的心肌细胞ROS的生成,抑制心肌肥大。此外,ANP可以抑制缺血再灌注诱导的肝细胞凋亡,而这种作用是通过ANP/NPR-A/cGMP系统的激活发挥作用的;体外实验发现ANP可以促进肝脏细胞热休克蛋白的表达,从而提高肝脏细胞抵抗ROS的损伤作用。而ANP/NPR-A在胎盘中是否具有抑制ROS的生成及细胞凋亡的保护功能,目前尚无文献报道。因此,本研究旨在:1、以早孕期底蜕膜组织、早孕绒毛、妊娠晚期胎盘为研究对象,采用免疫组化、免疫印记技术,明确ANP及其受体NPR-A在底蜕膜和胎盘中的分布特点;比较正常产妇及子痫前期患者胎盘ANP及其受体NPR-A的表达是否存在差异,为研究ANP/NPR-A在妊娠中的功能及子痫前期发病中的作用提供线索及切入点;2、以早孕期细胞滋养细胞株HTR8/SVneo为研究对象、用siRNA干扰技术降低其NPR-A受体的表达,观察NPR-A受体表达降低对HTR8/SVneo滋养细胞生物学行为的影响,以期为子痫前期的发病机制提供新的线索(第一部分研究提示PE胎盘滋养细胞NPR-A受体表达降低);3、构建缺氧诱导滋养细胞ROS升高及凋亡模型,探讨ANP/NPR-A是否可以抑制缺氧诱导的ROS蓄积及滋养细胞凋亡,并对其机制进行初步探讨。以期为子痫前期的发病机制提供新的理论线索。第一部分ANP及其受体NPR-A在蜕膜、胎盘的表达[研究目的]观察ANP及其受体NPR-A在早孕期底蜕膜、早孕绒毛和分娩胎盘中的分布特点;比较正常产妇及子痫前期患者胎盘ANP及其受体NPR-A的表达是否存在差异,明确ANP/NPR-A与子痫前期发病是否具有相关性,为研究ANP/NPR-A在子痫前期中的作用提供线索及切入点。[研究方法]样本的收集:1、随机收集在妇产科行剖宫产分娩的重度子痫前期孕妇10例,正常妊娠孕妇10例,收取分娩胎盘组织。所有孕妇为单胎妊娠,排除合并其他疾病及妊娠并发症,慢性高血压合并妊娠、妊娠合并慢性肾炎、妊娠期糖尿病、胎膜早破、妊娠合并其他炎性疾病等。2、随机选取早孕期行人工流产的孕妇,收集蜕膜组织及绒毛组织。纳入标准:孕周8-13周、月经周期规律、行早孕期畸形筛查及早孕B超未见异常,未服用任何保胎药物如雌激素、孕激素等。排除标准:唐氏筛查高风险、早孕B超提示异常、胚胎停育者及行人工助孕者。实验方法:采用免疫组化明确ANP及NPR-A在早孕期底蜕膜、早孕绒毛及分娩胎盘中的表达定位及分布特点;通过免疫印迹法比较正常胎盘与重度子痫前期胎盘中ANP及NPR-A受体的表达。采用SPSS13.0对研究数据进行统计分析,实验结果以均数±标准差表示,采用两独立样本t检验进行统计分析,设双侧检验,P<0.05为有统计学意义。[研究结果]1、ANP及NPR-A在蜕膜及胎盘中的表达:ANP及NPR-A主要表达于早孕期底蜕膜腺上皮细胞、蜕膜的间质细胞。而蜕膜间质ANP(+)及NPR-A(+)细胞主要分布于子宫螺旋动脉周围,而在螺旋动脉周围的区域CD56+NK细胞以及HLA-G阳性滋养细胞表达阳性。经蜕膜连续切片染色发现,蜕膜细胞滋养细胞ANP及NPR-A表达阳性。在早孕绒毛及妊娠晚期胎盘中,ANP及NPR-A主要表达于合体滋养细胞、绒毛内细胞滋养细胞中。2、ANP和NPR-A在正常胎盘和重度子痫前期胎盘中的表达:重度子痫前期患者胎盘中ANP表达量与正常组相比无显著性差异(0.6800±0.11301 vs 0.6519±0.07650;P=0.582);而重度子痫前期患者胎盘NPR-A表达量较正常组显著降低(0.9257±0.13907 vs 0.5312±0.13884;P=0.000)[研究结论]底蜕膜细胞滋养细胞、腺上皮、胎盘合体滋养细胞、绒毛内滋养细胞均表达ANP及NPR-A;提示ANP及其受体可能在调节合体滋养细胞的功能及细胞滋养细胞功能中具有重要的作用。而子痫前期胎盘中NPR-A表达显著降低,提示NPR-A异常可能通过影响滋养细胞的功能参与了子痫前期的发病过程。第二部分siRNA靶向沉默NPR-A受体的表达对滋养细胞生物学行为的影响[研究目的]采用siRNA干扰技术靶向下调HTR8/SVneo滋养细胞NPR-A受体的表达,明确NPR-A受体对滋养细胞生物学行为的影响,以期为子痫前期的发病机制提供新的理论依据。[研究方法]采用siRNA干扰技术靶向沉默HTR8/SVneo滋养细胞NPR-A受体的表达。实验分组:空白对照组(仅转染空载体)、阴性对照组(转染非目的基因的阴性序列)、NPR-A-siRNA组(转染NPR-A目的序列)。分别采用CCK8法、transwell小室法及Annexin V/PI法检测及比较各组间HTR8/SVneo细胞的增殖能力、侵袭能力及凋亡凋亡率。采用SPSS13.0对研究数据进行统计分析,实验结果以均数±标准差表示,采用单因素方差分析(One-way ANOVA)进行统计分析,设双侧检验,数据方差齐时,组间多重比较采用LSD法;方差不齐时,组间多重比较采用Dunnett’s T3法进行比较P<0.05为有统计学意义。[研究结果]1、靶向下调NPR-A对HTR8/SVneo滋养细胞增殖功能的影响:研究发现,经转染24h、48h、72h后阴性对照组、空白对照组、NPR-A-siRNA组间滋养细胞 OD 值无显著性差异[24h:F=2.904,P=0.094(阴性对照 vs NPR-A-siRNA,P=0.095);48h:F=2.411,P=0.135(阴性对照vs NPR-A-siRNA,P=0.379);72h:F=1.262,P=0.318(阴性对照vsNPR-AsiRNA,P=0.139)]。提示下调NPR-A受体的表达对HTR8/SVneo滋养细胞的增殖能力无显著影响。2、靶向下调NPR-A的表达对HTR8/SVneo滋养细胞凋亡的影响:经研究发现,空白对照组、阴性对照组、NPR-A-siRNA组转染后48h凋亡率分别为3.80%±0.53%、3.98%±0.16%、4.84%±0.66%,差异无统计学意义[F=3.671,P=0.091;其中阴性对照组vs NPR-A组P=0.081];空白对照组、阴性对照组、NPR-A-siRNA组转染后72h凋亡率分别为5.00%±0.52%、4.88%±0.33%、5.83%±0.30%,差异无统计学意义(F=4.947,P=0.054;其中阴性对照组vs NPR-A组P=0.061);提示靶向下调NPR-A的表达对滋养细胞的凋亡无显著性影响。3、靶向下调NPR-A的表达对HTR8/SVneo滋养细胞侵袭能力的影响:阴性对照组及空白对照组HTR8/SVneo滋养细胞的侵袭能力无显著性差异:阴性对照组及空白对照组24h穿过下室的滋养细胞数分别为(41.16667±5.407626 VS 42.12500±5.276295),两组间无显著性差异(P=0.666)。而转染NPR-A-siRNA后,穿过下室的滋养细胞数量较阴性对照组显著减少(42.12500±5.276295vs 25.83333±3.761850,P=0.000),提示滋养细胞的侵袭能力显著降低。[研究结论]NPR-A受体表达降低可抑制滋养细胞的侵袭能力,提示子痫前期患者胎盘NPR-A受体表达降低可能通过影响滋养细胞的侵袭能力,参与了子痫前期的发病过程。第三部分心钠素通过抑制凋亡通路减轻缺氧诱导的滋养细胞凋[研究目的]探讨ANP/NPR-A途径是否可以抑制缺氧引起的ROS蓄积及滋养细胞凋亡,并对其机制进行初步探讨。[研究方法]采用六水合氯化钻(coc12.6H2O)构建HTR8/SVneo缺氧模型。实验分组:1、空白对照组:加PBS作为刺激2、化学缺氧组:单纯添加cocl2;3、ANP预处理组:化学缺氧前添加ANP(1×10-7mol/L)进行预处理1h;4、NPR-A受体抑制剂组(A71915):采用NPR-A抑制剂(1×10-7mol/L)预处理30min,随后添加ANP及cocl2进行缺氧处理。24h后采用CCK8检测各组细胞的活性;Annexin V/PI染色、流式检测各组凋亡率;DCFH-DA染色、流式检测各组ROS的水平;Rhodanmin 123染色、流式检测各组线粒体膜电位水平;westernblot法检测各组细胞色素c、活化的caspase9、caspase3的表达。采用SPSS13.0对研究数据进行统计分析,实验结果以均数±标准差表示,采用单因素方差分析进行统计分析,设双侧检验,数据方差齐时,组间多重比较采用LSD法;方差不齐时,组间多重比较采用Dunnett’s T3法进行比较,P<0.05为有统计学意义。[研究结果]1、氯化钴可以显著的降低HTR8/SVneo细胞的活性,且这种抑制作用具有剂量依赖性,剂量越大抑制作用越明显。经计算IC50剂量为550umol/L因此本实验采用550umol/L作为本实验缺氧损伤模型的浓度。2、ANP抑制缺氧诱导的滋养细胞凋亡:经过Cocl2诱导缺氧24小时,HTR8/SVneo滋养细胞的凋亡率较空白对照组显著增加(4.63%±1.04%VS 16.36%±1.42%,P=0.000)。而在缺氧前经过ANP(1×10-7mol/L)预处理后,滋养细胞的凋亡率较单纯缺氧组显著降低(16.36%±1.42%avs 6.87%±0.66%P=0.000),提示ANP具有抑制缺氧诱导的凋亡的作用。而NPR-A受体抑制剂A71915可部分抑制ANP的抗凋亡作用:与ANP组相比,NPR-A抑制剂组凋亡率显著升高(11.27%±1.09%vs 6.87%±0.66%,P=0.00)。3、ANP抑制缺氧诱导的ROS的生成:由流式细胞术的结果可以看出,缺氧可以诱导HTR8/SVneo滋养细胞ROS的生成。与空白对照组相比较,给予氯化钴缺氧24h后,HTR8/SVneo滋养细胞内ROS的荧光强度显著增加(222.00±41.61 VS 1201.67±66.73,P=0.00)。而给予 ANP 预处理后,HTR8/SVneo 滋养细胞ROS的荧光强度显著降低(1201.67±66.73 VS 588.00±69.54,P=0.00)。NPR-A受体抑制剂可以削弱ANP抑制滋养细胞ROS生成的作用(588.00±69.54 vs888.33±44.38 P=0.00)。这提示了ANP具有抑制缺氧诱导的HTR8/SVneo滋养细胞内ROS生成的作用,而这种作用部分是由NPR-A所介导的。4、心钠素抑制缺氧诱导的滋养细胞线粒体膜电位的降低:与空白对照组相比,coc12诱导HTR8/SVneo滋养细胞缺氧24小时后Rhodamin 123的平均荧光强度显著降低(548.00±49.1VS235.00±21.37,P=0.000),而在缺氧前经过ANP(1×10-7mol/L)预处理可以稳定HTR8/SVneo滋养细胞的线粒体膜电位:ANP预处理组Rhodamin 123的平均荧光强度显著高于单纯的cocl2缺氧组(357.00±58.28 vs 235.00±21.37,P=0.008)。而NPR-A抑制剂A71915可以部分抑制ANP的保护作用:与ANP预处理组相比,使用NPR-A受体抑制剂后Rhodamin 123 的荧光强度显著降低。(246.66±28.57vs357.00±58.28,P=0.012)。5、ANP可以抑制细胞色素c的释放,降低Caspase3及Caspase9的活化:细胞缺氧后细胞浆内细胞色素c的含量较空白对照组显著升高(空白vs缺氧:0.2423±0.01514 vs 0.5161±0.03099,P=0.00),并显著上调活化的caspase 9(空白 vs 缺氧:0.4533±0.04041 vs 0.8500±0.02000,P=0.00)及caspase3(空白 vs 缺氧:0.3533±.04726 vs.6767±.05132,P=0.00)的表达。ANP可以显著降低细胞质内细胞色素c的含量(缺氧vs ANP预处理:0.5161±0.03099 vs 0.3463±0.03649,P=0.00)及活化的caspase 9(缺氧vs ANP预处理:0.8500±0.02000 vs 0.5400±0.02000,P=0.00)、caspase 3(缺氧vs ANP预处理:0.6767±0.05132 vs 0.4800±0.03000,P=0.00)的表达。而NPR-A受体抑制剂A71915可以部分抑制ANP的这种效果:与ANP预处理组相比,NPR-A受体抑制剂组细胞色素c含量(ANP 预处理 vs NPR-A 受体抑制剂 0.3463±0.03649 vs 0.4458±0.02800,P=0.003)、活化的caspase 9(ANP预处理 vs NPR-A受体抑制剂 0.5400±0.02000 vs 0.6400±.03000,P=0.003)及caspase 3(0.4800±0.03000 vs 0.5700±0.02000,P=0.023)的表达均显著升高。[研究结论]:1、六水合氯化钴诱导的化学性缺氧可以降低滋养细胞的活性,增加ROS的生成、并通过线粒体凋亡通路诱导HTR8/SVneo滋养细胞出现凋亡。2、心钠素ANP可以减少ROS的生成,通过抑制线粒体凋亡通路减轻缺氧诱导的HTR8/SVneo滋养细胞凋亡;而这种抑制作用部分是通过NPR-A受体介导的。全文小结1、本研究发现ANP及NPR-A受体主要表达与早孕蜕膜中的腺上皮细胞及细胞滋养细胞;早孕绒毛及分娩胎盘中的合体滋养细胞及绒毛内细胞滋养细胞中。2、研究发现,NPR-A受体在子痫前期胎盘中表达降低,。3、研究发现,NPR-A受体表达降低可抑制滋养细胞的侵袭能力。提示子痫前期胎盘NPR-A表达降低可能通过抑制滋养细胞的功能参与子痫前期的发病过程。4、研究发现,心钠素ANP通过与NPR-A受体作用,抑制缺氧诱导的ROS生成及线粒体凋亡通路,从而降低缺氧诱导的滋养细胞凋亡。总之,本研究初步探讨了 ANP及其受体NPR-A的表达与功能,为研究ANP/NPR-A通路在妊娠及子痫前期中的作用提供了新的理论线索。