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猪瘟病毒(CSFV)与SARS冠状病毒(SARS-CoV)、禽流感病毒(AIV)、口蹄疫病毒(FMDV)、登革热病毒(denguevirus，DV)、丙型肝炎病毒(HCV)、脊髓灰质炎病毒(poliovirus)和牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(BVDV)等都是严重危害牲畜和人类的病原体，这些病毒在一些国家和地区的传播造成经济上的巨大损失，社会上的极度恐慌，对人类的生命健康造成极大的威胁。猪瘟与禽流感一样都被国际兽疫局和我国政府列为A类传染病，患猪瘟的牲猪没有合适的方法予以治疗，只能靠大面积的圈杀以阻止疾病的蔓延。虽然这些病毒存在着差异，但却有着本质上的相似性，都属于RNA病毒，它们的基因组为RNA，在遗传物质垂直传递过程中没有DNA状态出现，都要靠RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependentRNApolymerase，RdRp)来完成病毒的复制。正因为这样，每一种病毒的研究成果都为其它病毒的研究提供借鉴，特别是在病毒的复制机理上。然而，这些病毒的复制机理远远没有解决。
从BVDV和HCV的研究表明，复制酶首先在3非翻译区(3UTR)结合，以正链RNA为模板合成负链RNA，然后再以新合成的负链RNA为模板合成正链RNA(Gongetal.，1996)，因此，3UTR被认为是RNA病毒复制起始的第一调节位点。要弄清病毒的复制机理首先要弄清RNA病毒3UTR的结构与功能的关系。本文以正链RNA病毒的典型代表CSFV为对象，对3UTR的结构与功能的关系进行了系统的研究。
1、3非翻译区和NS5B蛋白是CSFVRNA基因组复制起始的所必需。CSFV全长的NS5B蛋白的编码基因从CSFV基因组中克隆出来，然后在大肠杆菌细胞中得到表达，用C-末端6组氨酸标签进行纯化后，与CSFV基因组3UTR一起温育，发现有新合成的RNA产物，而在没有3UTR存在的RNA聚合反应中，检测不到RNA产物，说明在大肠杆菌细胞中表达的CSFVNS5B蛋白必须在3UTR上起始RNA的合成，大肠杆菌细胞中表达的CSFVNS5B蛋白的RdRp活性必须在3UTR存在时才能体现。作为比较，我们还在大肠杆菌中表达和纯化了C-末端缺失24、36、65或82个氨基酸的截短的CSFVNS5B2蛋白。将C-末端缺失24、36或65个氨基酸的NS5B蛋白分别与CSFV基因组3UTR一起温育，这些C-末端缺失的NS5B蛋白仍然表现出RNA依赖的RNA聚活酶活性，然而，该活性在C-末端缺失82个氨基酸的NS5B蛋白没有发现。对具有RdRp活性的NS5B蛋白的模板特异性进行了分析，C-末端缺失的NS5B蛋白模板特异性不严格，而C-末端不缺失的、全长的NS5B蛋白模板特异性严格一些，暗示CSFVNS5B蛋白的C末端可能与模板的特异性有关。模板的3末端的定点诱变以及二级结构预测等实验表明：3UTR3末端的胞嘧啶以及正确的二级结构对于3UTR引导RdRp起始RNA合成是必需的。对3UTR的3末端的羟基进行了氧化，与没有氧化的3UTR平行地进行RdRp反应，均发现了新合成的RNA产物，表明存在着从头合成机制。然而，在没有氧化的模板的RdRp反应中，长于模板的RNA产物的出现说明模板引物机制可能也是RdRp使用的机制之一。
NS5B基因从CSFV基因组中克隆，在CSFV的宿主细胞、猪肾细胞PK-15中表达。用不同浓度的盐、甘油和去污剂组成的细胞裂解缓冲剂纯化细胞提取液得到四种组分：SC、S1、S2和S3。SDS-PAGE和Westernblotting分析显示，这些组分都含有NS5B蛋白。RdRp分析显示，仅在包含SC的RdRp反应产物中检测到新合成的RNA，而在分别包含S1、S2和S3的RdRp反应中检测不到RNA产物，表明仅组分SC含有所有起始RNA的合成的必需成分，而组分S1、S2和S3虽然也都含有NS5B蛋白，但起始RNA的合成的其它必需成分可能在纯化的过程中有些丧失。
猪瘟兔化弱毒疫苗株(HCLV)是从猪瘟病毒强毒株(CSFV)石门株(Shimenstrain)选育的弱毒株。分别从CSFV弱毒株和CSFV强毒株的基因组中克隆出NS5B基因，在原核细胞体系中表达，得到的表达产物用Ni-NTA树脂纯化，SDS-PAGE和Westernblotting分析显示表达产物中均含有丰富的NS5B蛋白。用RNA聚合反应检验NS5B蛋白的RNA聚合酶活性，发现CSFV弱毒株的NS5B蛋白和CSFV强毒株的NS5B蛋白都是相应病毒的复制酶，需要在相应的3UTR上起始RNA的合成。进一步的研究的表明，在相同的3UTR上，弱毒株和强毒株的NS5B蛋白合成RNA的数量相等，说明无论是CSFV弱毒株，还是CSFV强毒株，它们的RNA依赖的RNA聚合酶有相等的酶活性。
2、3非翻译区序列与结构的变化直接影响着CSFVRNA基因组复制的起始用带各种缺失突变信息的引物进行PCR和体外转录来突变3UTR，将3UTR的大部分序列去除，仅保留3末端28、27、26、23、21和20个核苷酸，将这些保留下来的3UTR的3末端28、27、26、23、21和20个核苷酸形成RNA模板，分别纳入RNA聚合酶反应，RNA产物均在包含3UTR的3末端28、27、26、23、21个核苷酸RNA模板的RNA聚合酶反应中得到验证，而在包含3UTR的3末端20个核苷酸的反应产物中没有新合成的RNA，仅保留3末端28、27、26、23、21核苷酸的3UTR仍然有引导RNA合成的功能，而这个保留数值最小是21，因为3末端仅保留20个核苷酸的3UTR就失去了引导RNA合成的功能。就象所期望的那样，保留3UTR的其余部分，而去除3末端21核苷酸所形成RNA模板也不能引导RNA合成，所以3UTR3末端的21个核苷酸是3UTR起始基因组RNA复制所必需的位点，而3UTR的其余部分的缺失则使RNA的合成数量下降。而且去除3末端21核苷酸的3UTR失去了与复制酶结合的能力。
在这21个核苷酸中，突变第216位的T、摧毁3UTR的3末端的C均使RNA合成流产，而突变第212位的T，则仍然能起始RNA的合成，但却减少了RNA的合成量。突变形成4个在第219位含突变的3UTR中，3个已失去活性，1个还能起始RNA合成。因此，我们可以得出结论：在3UTR指导RNA合成的过程中，第216位最重要，第212位最不重要，第219位的G和第228位的C也很重要。
对比CSFV弱毒株和石门强毒株的基因组，不难发现CSFV弱毒株的基因组3UTR中存在一个12个核苷酸‘CTTTTTTCTTTT’的插入。我们发现，当这12个核苷酸的插入从弱毒株3UTR中去除之后，RNA的合成就增加。当该插入保留在3UTR中，RNA的合成就下降。当该插入引入到CSFV石门株3UTR中后，RNA合成就降低。无论是在弱毒株和石门强毒株，用另一个插入‘ATTATTATTTAT’取代原来‘CTTTTTTCTTTT’的插入，提高RNA的合成。因此，该插入被认为可能是HCLV减毒的一个标志。
我们又发现，当这个插入缺失时，HCLV株的3UTR的二级结构就更稳定，而当这个插入引入到CSFV石门株3UTR中后，该3UTR的二级结构就变得较不稳定。无论是在HCLV株和石门株，用另一个插入‘ATTATTATTTAT’取代原来‘CTTTTTTCTTTT’的插入则稳定了二级结构，提高了RNA的合成产量。看来，3UTR的二级结构的稳定与否直接关系到RNA的合成数量。不仅这样，3UTR的二级结构的稳定与否直接关系到RNA的合成是否起始。我们使用软件RNAstructure-3.5对带有3末端胞嘧啶缺失突变的3UTR的二级结构进行了预测，缺失3末端1个和2个连续的胞嘧啶后，带突变的3UTR的二级结构模型与野生型的没有明显的区别，两种突变都没有影响RNA的合成。相反，没有3末端胞嘧啶以及缺失3-CCCGG片段后的3UTR的二级结构的模型与野生型的有很大的区别：野生型的模型的第1茎环中有4个环，没有3末端胞嘧啶或没有3-CCCGG片段的3UTR模型的第一茎环包含3个环，这两种突变均导致RNA合成能力的丧失。
3、从基因组3非翻译区看猪瘟病毒的进化位置猪瘟病毒基因组3非翻译区是病毒复制的重要调节位点，基因组3UTR的变异应该可以反映病毒的系统发生和进化关系。弄清病毒的进化关系为研究病毒的重组机制、研究病毒的起源、从根本上防止病毒恣意扩散、研制有效的抗病毒药物奠定坚实的基础。
对GENBANK数据库中76株已公布的包括CSFV在内的黄病毒科病毒的3UTR序列进行收集、整理，运用CLUSTALW软件对76株核苷酸序列进行全序列比较和对齐，用TreeViewX软件将对齐后的序列以树型结构输出，得到包括CSFV在内的76株病毒的进化树。黄病毒科病毒被分为三个进化簇，且属于同科同属的病毒大多在进化树上表现出了较近的亲缘关系，这与相关的文献把黄病毒科病毒分为三类相符。在进化树上，CSFV、牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(BVDV)和绵羊边界病病毒(BDV)分散在第一个进化簇的第一个分支中，不同CSFV病株比较集中分布在第一个分支中的一个亚分支里。这与传统的分类方法将这三种病毒集中在同一属-瘟病毒属相符。以上结果同时显示基于病毒复制的重要调节位点，基因组3非翻译区，来分析病毒的系统发生和进化关系是可行的。