水红花子对大鼠肝再生和骨髓细胞增殖的影响

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目的:按Higgins等方法制作大鼠部分肝切除模型,研究水红花子对大鼠肝再生和骨髓细胞增殖的影响,为临床治疗肝脏疾病提供实验依据和理论支持。方法:通过2/3部分肝切除手术制备大鼠肝再生模型,将健康成年Wistar大鼠随机分为六组,分别为:假手术组(sham-operation,SO)、部分肝切除模型组(partialhepatectomy,PH)、环磷酰胺阳性对照组(cyclophosphamide,CP)和水红花子水提物(extract from fructus polygoni orientalis through water,EFPO)小、中、大剂量组。EFPO组大鼠分别灌胃(intragastrically,i.g.)0.9g·kg-1、1.8g·kg-1、3.6g·kg-1的EFPO,阳性对照组大鼠腹腔注射(intraperitoneally,i.p.)0.03g·kg-1的环磷酰胺注射液,PH和SO组大鼠i.g.等量的生理盐水,连续给药7天。处死动物,摘取大鼠肝脏右叶,用10%中性甲醛固定,常规脱水后石蜡包埋,制作石蜡切片。采用免疫组织化学方法,检测肝脏组织的细胞核增殖抗原(proliferating cell nuclear antige,PCNA)的表达情况;采用组织学染色方法(hematoxylin-eosin staining,HE),观察肝脏组织的形态学变化;分别取肝脏、胸腺、脾脏,精密称重,计算各脏器指数;分离大鼠骨髓细胞,采用免疫细胞化学方法,检测骨髓细胞涂片的PCNA表达情况;用60%percoll密度梯度离心法分离纯化大鼠骨髓单个核细胞(bone marrow mononuclear cells,BMNC),流式细胞术检测骨髓细胞周期;做大鼠骨髓印片,瑞氏-吉姆萨双染色,观察骨髓有核细胞增生程度和骨髓有核细胞形态学变化;用最大给药量评价水红花子的安全性。结果:EFPO对大鼠肝再生的影响:①从肝脏组织的PCNA免疫组织化学染色可以看出,EFPO3.6g·kg-1剂量组大鼠肝细胞PCNA的阳性表达率显著低于模型组大鼠(P <0.05),呈剂量依赖性。②HE染色结果显示,和模型组相比,EFPO各剂量组肝细胞沿中央静脉呈放射状排列,肝血窦腔增大,EFPO3.6g·kg-1剂量组最明显。EFPO3.6g·kg-1剂量组可见个别细胞核增大,远离中央静脉,汇管区可见肝细胞呈轻度气球样变性,并且出现点状坏死灶。③EFPO明显抑制了肝再生大鼠肝脏、胸腺和脾脏的重量,胸腺与脾脏重量明显低于模型组(P <0.05,P <0.01)。计算各脏器指数发现,EFPO3.6g·kg-1剂量组肝指数与模型组比较具有显著性差异(P <0.05),EFPO1.8g·kg-1、3.6g·kg-1剂量组胸腺指数和脾脏指数明显低于模型组(P <0.05)。EFPO对部分肝切除大鼠骨髓细胞增殖的影响:①观察部分肝切除大鼠骨髓细胞的PCNA免疫细胞化学染色,发现EFPO1.8g·kg-1、3.6g·kg-1剂量组大鼠骨髓细胞PCNA的阳性表达率明显低于模型组大鼠(P <0.05),提示大剂量EFPO对骨髓细胞增殖有抑制作用。②通过流式细胞仪检测骨髓细胞DNA含量和细胞周期,和模型组比较,EFPO3.6g·kg-1剂量组G1、G2期DNA含量明显降低(P <0.05)。EFPO各剂量组G0/G1期细胞数明显增多(P <0.05),G2/M期和S期细胞数相对减少。③吉姆萨-瑞氏双染色结果显示,与模型组相比,EFPO各剂量组有核细胞数量降低,成熟红细胞数量有所增加。与模型组相比,EFPO各剂量组大鼠骨髓有核细胞增生程度降低,CP组出现骨髓抑制现象,增生重度减低,PH和SO组骨髓增生明显活跃。水红花子灌胃给药的小鼠最大给药量为148.8g·kg-1,相当于临床成人一日口服量的89.3倍,表明水红花子灌胃给药148.8g·kg-1是安全的。结论:①EFPO抑制了大鼠肝再生;②EFPO抑制了大鼠骨髓细胞的增生,抑制程度弱于CP;③EFPO按临床成人一日口服量的89.3倍给予小鼠一日最大给药量,没有发现死亡,提示EFPO具有良好的安全性。
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