褐飞虱四个发育相关基因的克隆与mRNA表达分析

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褐飞虱Nilaparvata lugens (Stal)属同翅目Homoptera飞虱科Delphacidae,是亚洲国家的一种重要水稻害虫。目前,化学防治仍是控制褐飞虱的首要选择。然而,大量化学药剂的不合理使用已导致褐飞虱对包括有机磷类、氨基甲酸酯类、拟除虫菊酯类、新烟碱类、苯基吡唑类杀虫剂和一些昆虫生长调节剂在内的多种杀虫剂产生了抗药性,且部分杀虫剂造成褐飞虱天敌群落破坏以及亚致死剂量杀虫剂刺激褐飞虱生殖,由此引发的褐飞虱再猖獗问题已经引起了广泛关注。组蛋白乙酰转移酶和去乙酰化酶以及液泡型H+-ATPase (V-ATPase)在昆虫生长发育过程中具有重要作用。本文对组蛋白乙酰转移酶ELP3和Mof,去乙酰化酶HDAC3及V-ATPase d亚基等几个与昆虫生长发育相关基因进行了克隆和序列分析,并研究了这些基因在褐飞虱不同发育阶段的mRNA表达动态以及亚致死剂量三唑磷对其表达水平的影响。采用RT-PCR和RACE技术获得了褐飞虱ELP3、Mof、HDAC3和V-ATPase基因的全长cDNA序列。ELP3的开放阅读框长1656bp,编码551个氨基酸,预测分子量63.06251kDa。Mof的cDNA序列全长1440bp,包括编码450个氨基酸的1353bp开放阅读框,预测分子量53.44258kDa。HDAC3的开放阅读框长1299bp,编码433个氨基酸,预测分子量49.07634kDa。V-ATPase d亚基基因的cDNA序列长1247bp,包括编码349个氨基酸的1050bp开放阅读框,预测分子量39.52216kDa。SMART在线分析发现,ELP3含有延伸因子Elp3结构域和乙酰转移酶Pfam:Acety ltransf1结构域,Mof含有CHROMO结构域、乙酰转移酶结构域Pfam:MOZSAS和锌指结构域ZnFC2H2, HDAC3含有一个Pfam:Histdeacetyl结构域和Blast:STYKc结构域,V-ATPase基因含有一个Pfam:vATP-syntAC39结构域。多重序列比对表明,褐飞虱ELP3、Mof、HDAC3和V-ATPase基因与其他昆虫同源基因具有很高的序列一致性。通过荧光定量PCR研究了这些基因在褐飞虱不同发育阶段的mRNA表达动态。结果表明,ELP3基因在所有发育阶段以长翅雌虫表达水平为最高,在4龄若虫中的表达水平最低。其中,雌虫的表达量显著高于雄虫表达量,若虫ELP3基因表达水平以1龄若虫为最高。Mof基因在若虫阶段的表达无明显差异;在成虫中,雌虫表达量显著高于雄虫,其中又以长翅雌虫表达量最高,长翅雄虫表达量最低。HDAC3基因在雌成虫中的表达水平显著高于雄虫的表达,各发育阶段的相对表达量又以长翅雌虫为最高。V-ATPase基因在2龄若虫的表达水平有一个峰值,然后开始下降,在短翅雄虫中的表达水平达到一个相对较低的水平。通过荧光定量PCR分析了亚致死剂量三唑磷对相关基因表达水平的影响,结果表明:羽化1天后,LD30三唑磷处理的短翅雌虫ELP3基因相对表达量显著上升为对照的1.60倍,长翅雌虫表达量显著下降至对照的0.31倍。羽化3天后,LD30处理短翅雌虫ELP3相对表达量显著上升,是对照的2.03倍,而长翅雌虫ELP3相对表达量显著降为对照的0.57倍。羽化1天后,LD1o和LD30三唑磷处理短翅雄虫Mof基因表达量显著下降,分别是对照的0.43和0.61倍;LD30处理的长翅雌虫和雄虫Mof相对表达量显著降低,分别是对照的0.52和0.70倍。羽化3天后,LD1o三唑磷处理的雄虫Mof相对表达量显著降低,是对照的.52和0.54倍。羽化1天后,LD30三唑磷处理短翅/长翅雄虫HDAC3基因相对表达量显著下降,是对照的0.67、0.65倍。羽化3天后与对照相比,LD1o和LD30三唑磷处理短翅雌虫体内HDAC3表达量显著上升,相对表达量分别是对照的1.94和2.00倍;长翅雄虫HDAC3表达水平比对照显著减少,其相对表达倍数分别是对照的0.37和0.69倍。羽化3天后,LD1o和LD30三唑磷处理短翅雄虫V-ATPase d亚基基因的表达显著升高,其相对表达倍数分别是对照的2.15和2.46倍。
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