目的:最新的肿瘤流行病学数据显示,肺癌已是全球范围内发病率及死亡率均居首位的恶性肿瘤。80%以上的肺癌是非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)。肺腺癌(lung adenocarcinoma,LAD)和肺鳞癌(lung squamous cell adenocarcinoma)是NSCLC主要组织学类型,前者约占所有肺癌的40%,后者约占25%。目前肺腺癌致病机理尚未明晰,导致确诊早期肺腺癌的标志物缺乏,且LAD术后易复发、易转移。尽管当前的治疗手段有了明显改善,但是肺腺癌的总体预后仍然很差,五年平均生存率仅为15%左右。因此,挖掘一些新的有效的肿瘤标志物或模型对肺癌患者进行预后不良风险评估,具有十分重要的临床价值。补体C1q肿瘤坏死因子相关蛋白6(complement C1qtumor necrosis factor-related protein 6,C1QTNF6)是近年来发现的进化上高度保守的脂肪因子超家族成员。多项研究发现,C1QTNF6广泛参与多种炎症过程,在血管炎症、炎症性肾损伤、类风湿性关节炎以及肿瘤发生发展过程中均具有重要作用。已有文献报道C1QTNF6表达水平的改变会影响肝癌、结肠癌、卵巢恶性肿瘤的转移,但C1QTNF6在肺腺癌中的表达特征未见报道。体外实验初步显示在肺腺癌细胞中沉默C1QTNF6的表达会抑制癌细胞的增长和侵袭,但由于缺乏体内实验证据,此结论说服力不够,尚需通过动物实验验证C1QTNF6在肺腺癌促癌基因的作用,开展动物实验是十分必要的。稳定的商品化的人类肿瘤移植模型用于研究PRC基因敲除对肺腺癌增殖和转移的影响,成功培育的裸鼠纯合突变体可以直观展示植入的肿瘤在生长、转移等方面的数据资料,这为开展本研究提供了可能。本研究旨在从TCGA肿瘤基因表达谱数据中寻找一些与肺腺癌预后相关的特异性基因,并从中挑选C1QTNF6作为肺腺癌患者的预后预测及个性化治疗的候选基因,探究C1QTNF6的表达水平与肺腺癌病理学分期的相关性,采用裸鼠动物模型研究C1QTNF6在肺腺癌发生过程中的调控作用,为该病的早期诊断、分子靶向治疗策略及预后判定提供理论依据。材料与方法:1.分别从TCGA和GEO数据库搜索到503例和115例肺腺癌患者的转录组及相关临床数据作为构建肺腺癌预后风险模型的训练集合和验证集合,并从59个TCGA-LAD样本的肿瘤组织和癌旁组织检测差异表达基因。2.随机森林算法用于风险模型构建基因的鉴定;COX多因素回归方法对训练集合中的样本进行风险打分,评估风险分值和临床变量及生存时间的相关性;Kaplan-Meier生存曲线评估高、低风险组的生存差异,并用验证数据集进行检验;卡平方检验高、低风险组中肿瘤期患者生存时间的差异显著性。3.R包limma中的voom用于筛选TCGA-LAD高、低风险组样本的显著差异表达基因;在线基因功能注释工具Web Gestalt用于差异表达基因的GO和KEGG pathway富集分析;基于最新的In Web＿In Bio Map数据库构建预后风险预测模型涉及基因的PPI网络。4.稳定的C1QTNF6 si-RNA干扰表达体系(si-C1QTNF6)和pc过表达体系,同时设置空白对照组(Blank control)、阴性对照组(si-NC、pc-NC);体外实验载体选用肺腺癌细胞系SPCA1和A549。5.采用qRT-PCR技术在细胞水平去验证分别沉默或pc处理后对C1QTNF6表达的抑制或促进作用;分别采用MTT、克隆形成、划痕实验、Transwell迁移实验检测沉默或过表达(pc)处理后对肺腺癌细胞增殖、迀移及侵袭等生物学功能的影响;流式细胞术Annexin-V(APC染色)和流式细胞术PI染色法分别检测沉默或pc处理C1QTNF6后的肺腺癌细胞在凋亡和细胞周期的变化情况;运用Western blot技术分别探究C1QTNF6被沉默或过表达与肺腺癌细胞SPCA1和A549凋亡调控蛋白及细胞周期调控因子蛋白表达变化的关系。6.构建BALB/c裸鼠皮下瘤模型,分别向裸鼠皮下注射C1QTNF6沉默或过表达的人肺腺癌细胞株SPCA1和A549,对比观察裸鼠皮下瘤生长速度和瘤体体积。7.运用qRT-PCR、Western blot以及免疫组化等实验方法检测C1QTNF6在皮下瘤中的转录和表达水平;利用HE染色和TUNEL染色技术呈现在皮下瘤中干扰C1QTNF6的表达对人肺腺癌细胞的生长、转移的影响;运用qRT-PCR、Western blot方法揭示在肺腺癌细胞中沉默C1QTNF6的表达对癌细胞转移正向调控蛋白MMP-2、MMP-9以及细胞凋亡正向调控因子Caspase-3、Caspase-9表达水平的影响,从正反两个方面探究C1QTNF6对肺腺癌实体瘤组织的细胞转移及凋亡的作用。结果:1.与癌旁正常组织相比,肺腺癌组织中共有18,567个显著差异表达基因被检出,其中15,483个在肿瘤组织中显著高表达,剩下的表达则显著降低;通过COX单因素回归分析,共获得279个与患者生存时间显著相关的基因,通过贡献度排行,最终确定FAM83A、MYO1E、C1QTNF6、ERO1L排名前四位且在肿瘤组织的表达显著高于癌旁组织的基因作为构建预后风险模型基因;根据四基因FPKM值及相应患者的的生存状况,构建肺腺癌预后风险评分计算公式Risk score=0.00635*FAM83A+0.02114*MYO1E+0.04234*C1QTNF6+0.00634*ERO1L。2.利用构建的四基因预后风险模型,分别将训练集和验证集肺腺癌患者按照风险分值(risk score)划为高风险组和低风险组;通过风险分值与临床变量的单因素和多因素COX回归分析发现,只有risk score和临床分期(Stage)与训练集肺腺癌患者的生存显著相关(P<0.01),验证集中只有risk score与患者生存时间显著相关(P<0.05);KM曲线分析发现两个数据集中高、低风险组的生存时间存在显著差异(P<0.05)。3.与低风险组相比,在高风险组中表达显著上调基因的有118个,下调的有175个;GO富集结果表明这些差异基因主要参与细胞外结构、循环系统发育细胞粘附、细胞迁移等生物学过程,提示预后差异很有可能与肿瘤细胞的扩散和转移进程有关;KEGG pathway富集结果也显示这些基因被显著富集到焦点粘连、胞外基质受体相互作用、蛋白质消化吸收等与肿瘤紧密相关的通路中。4.基于In Web＿In Bio Map数据库的蛋白质互作信息构建的蛋白质互作网络显示,与MYO1E、ERO1L、C1QTNF6、FAM83A互作的蛋白质数目依次是266、154、10和8个;GO功能富集分析表明,这些互作蛋白主要参与细胞周期进程:MYO1E互作蛋白调控细胞周期、ERO1L互作蛋白在细胞内核酸物质合成和组装中发挥作用、C1QTNF6互作蛋白参与了组蛋白的修饰与细胞周期进程、FAM83A互作蛋白与端粒复制过程密切相关。5.沉默C1QTNF6后肺腺癌细胞SPCA1和A549增殖、迀移及侵袭能力均受到了显著抑制,而过表达C1QTNF6则会显著促进这两个细胞株的增殖、迀移及侵袭;SPCA1细胞和A549细胞si-C1QTNF6组凋亡发生率分别为16.7%、9.23%,均明显高于各自pc-C1QTNF6组1.84%、1.40%(P<0.05)。细胞凋亡促进因子Caspase-3、Caspase-9、Bax蛋白表达量在这两组细胞si-C1QTNF6组中均明显增多,凋亡抑制因子Bcl-2蛋白表达显著下调。6.细胞周期结果显示:与空白组和NC组相比,SPCA1和A549细胞si-C1QTNF6组G1期细胞的比例显著高于其他时相,差异具有统计学意义(P<0.05);而pc-C1QTNF6组G1期细胞明显低于其他时相。细胞周期正调控因子Cyclin D1在这两细胞株pc-C1QTNF6组的表达量均明显增多,细胞周期抑制因子P27的蛋白表达则显著下降。7.皮下瘤生长实验结果显示沉默C1QTNF6会显著降低SPCA1和A549细胞在裸鼠体内的生长速度,减小瘤体体积,而过表达处理C1QTNF6则会显著提高肿瘤生长速度,增大瘤体体积。HE染色结果显示,沉默C1QTNF6会使实体瘤组织中的肺转移灶数量明显减少,而过表达处理C1QTNF6会显著增加瘤体中肺转移灶的数量。8.qRT-PCR和Western blot检测结果表明在C1QTNF6在si-C1QTNF6组的皮下瘤表达最弱,在pc-C1QTNF6组的皮下瘤表达最强。免疫组化染色结果显示:C1QTNF6抗体阳性信号在si-C1QTNF6组肺腺癌瘤组织中强度最弱,而过表达处理组的信号强度最强,差异有统计学意义(P<0.05)。9.TUNEL染色结果显示,si-C1QTNF6组中阳性细胞数较对照组和pc-C1QTNF6组均明显增多,qRT-PCR和Western blot定量分析结果表明,与空白对照组和阴性对照组相比,在沉默C1QTNF6表达的瘤体组织中细胞凋亡促进因子Caspase-3、Caspase-9的表达增强,参与肿瘤侵袭、转染的MMP-2、MMP-9的表达减弱;pc处理C1QTNF6会抑制Caspase-3和Caspase-9的表达而促进MMP-2和MMP-9的表达,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:1.基于MYO1E、ERO1L、C1QTNF6、FAM83A四基因构建的风险模型可以较好地将相关肺腺癌患者分为预后不良的两组:高风险组和低风险组,并能够独立于患者临床变量从而预测患者的预后。2.干扰C1QTNF6基因的表达可以显著促进肺腺癌细胞SPCA1和A549细胞凋亡,且可延迟细胞周期进程,阻滞细胞增殖以及迁移速度,从而抑制肺腺癌的发展。本研究通过探讨沉默C1QTNF6基因而对人肺癌细胞增殖和迀移等生物学特性的影响,初步证实C1QTNF6是肺腺癌的候选促癌基因,为临床分子靶向治疗肺癌提供理论依据。3.在动物体内干扰C1QTNF6基因的表达可以显著促进瘤体的细胞凋亡,抑制肺腺癌细胞的增殖及转移。动物模型实验证明C1QTNF6具有促进肺腺癌增殖和转移的功能,可以作为肺腺癌分子靶向治疗的新的基因标记物。