【摘 要】
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研究背景和目的:在全球范围内,骨质疏松是最常见的骨骼疾病,骨质疏松引起的骨折是导致疾病和死亡的重要原因,其疾病负担超过了癌症、风湿性和高血压等其他慢性疾病。虽然现在已经有很多治疗骨质疏松的药物,但是骨质疏松疾病的发生率仍然很高,说明我们对骨质疏松的发病机理的认识还远远不够。因此,阐明骨质疏松的发病机理,对于预防和治疗骨质疏松具有极其重要的临床意义。近年来,临床研究发现一类严重成骨发育不全的Cole
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研究背景和目的:在全球范围内,骨质疏松是最常见的骨骼疾病,骨质疏松引起的骨折是导致疾病和死亡的重要原因,其疾病负担超过了癌症、风湿性和高血压等其他慢性疾病。虽然现在已经有很多治疗骨质疏松的药物,但是骨质疏松疾病的发生率仍然很高,说明我们对骨质疏松的发病机理的认识还远远不够。因此,阐明骨质疏松的发病机理,对于预防和治疗骨质疏松具有极其重要的临床意义。近年来,临床研究发现一类严重成骨发育不全的Cole-Carpenter综合症,该疾病患者表现为骨脆性、颅骨缺损、眼球突出、脑积水和独特的面部特征。目前,已经明确 Cole-Carpenter 综合症是由蛋白质二硫键异构酶（protein disulfide isomerase,PDI）基因突变所致。但是,PDI基因在成骨细胞分化及骨发育中起什么样的作用?其突变或基因异常表达会引起哪些病理变化等关键科学问题仍不清楚。为了解决这些科学问题,本研究建立了 PDI成骨细胞特异性基因敲除小鼠,研究了 PDI在成骨细胞分化及骨发育中的作用,并初步阐明其作用机制。研究方法:1.采用Cre-Loxp重组系统,将OSX（成骨细胞特异性转录因子）启动子调控的Cre小鼠同PDI-floxed基因改造（PDIfl/fl）小鼠交配,获得PDI成骨特异性敲除小鼠（Osx-Cre/PDIfl/wt）。2.利用阿尔新蓝和茜素红对新生小鼠骨架染色,检测Osx-Cre/PDIfl/wt小鼠骨发育情况和骨矿化能力。3.利用X-射线,检测Osx-Cre/PDIfl/wt小鼠股骨的骨密度。4.应用钙黄绿素标记实验,检测Osx-Cre/PDIfl/wt小鼠的骨形成能力。5.利用 H＆E、抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase,TRAP）、Masson染色对Osx-Cre/PDIfl/wt小鼠股骨进行染色,检测小鼠成骨细胞、破骨细胞数量和胶原纤维的含量。6.为了研究PDI敲除是否影响血清中钙、磷和碱性磷酸酶的含量,对Osx-Cre/PDIfl/wt小鼠血清进行血生化检测。7.为了判断PDI敲除是否影响骨髓的造血能力,应用血细胞计数仪分析Osx-Cre/PDIfl/wt小鼠的血细胞数目。8.为了进一步研究PDI敲除对成骨细胞功能的影响,分离PDIfl/fl新生小鼠颅骨原代成骨细胞,应用Ad-GFP/Ad-Cre感染成骨细胞,同时对敲除成功的成骨细胞诱导分化14天,进行碱性磷酸酶和茜素红S染色。此外,为了研究PDI在成骨细胞中的作用底物,对敲除成功的成骨细胞进行诱导分化7天,裂解后进行蛋白质定量质谱分析。9.为了认识PDI敲除是在成骨细胞分化中的可能作用底物,应用qPCR检测成骨细胞分化中重要基因的mRNA水平。研究结果:1.应用PCR对成骨细胞PDI特异性敲除小鼠进行鉴定,发现成骨细胞全敲（Osx-Cre/PDIfl/fl）小鼠是胚胎致死的,只能得到成骨细胞杂合敲除（Osx-Cre/PDIfl/wt）小鼠。2.与对照小鼠相比,Osx-Cre/PDIfl/wt基因敲除小鼠的生长速度明显减缓,体型矮小,出现了严重的骨骼发育缺陷,股骨和胫骨的长度明显下降。3.对小鼠股骨进行X-射线分析,与对照小鼠相比,Osx-Cre/PDIfl/wt基因敲除小鼠的骨阻射程度明显下降,骨密度降低。4.对小鼠股骨进行H＆E、TRAP和Masson染色,与对照小鼠相比,Osx-Cre/PDIfl/wt基因敲除小鼠的成骨细胞和破骨细胞的数量下降,胶原纤维的含量明显下降。5.对小鼠进行血生化检测,与对照小鼠相比,Osx-Cre/PDIfl/wt小鼠血清的钙、磷、碱性磷酸酶水平均下降。6.对小鼠进行钙黄绿素标记,与对照小鼠相比,Osx-Cre/PDIfl/wt小鼠的骨形成速率明显下降。7.分离PDIfl/fl新生小鼠的颅骨成骨细胞进行体外培养,Ad-Cre感染成骨细胞,PDI敲除后并诱导其分化。PDI缺陷的成骨细胞碱性磷酸酶的活性降低,矿化能力下降。8.利用qPCR检测了成骨细胞分化相关基因的表达,发现PDI缺陷导致这些基因的mRNA水平下降。9.应用蛋白定量质谱分析,发现PDI缺陷导致胶原脯氨酰-4-羟化酶（Collagen prolyl-4-hydroxylase,C-P4H）的 α 亚基 P4HA1、P4HA2、P4HA3 的表达均下降。研究结论:PDI在成骨细胞分化和骨形成中起关键作用,PDI影响成骨细胞中C-P4H的α亚基表达,使得胶原形成障碍,抑制成骨细胞的分化和功能。
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