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鸡白痢沙门菌是严重危害我国禽养殖业发展的常见病原菌之一,可导致雏鸡高发病率和死亡率,成年鸡多呈隐性感染,但能将该菌垂直传播给后代。种群净化和抗生素的使用虽然常被用来控制鸡白痢沙门菌,但由于成本高、药物残留及沙门菌耐药等问题,不能完全满足包括中国在内的发展中国家防控沙门菌病的需求。目前,疫苗接种被认为是降低鸡群感染和防控鸡白痢沙门菌的有效措施之一。本实验室的前期研究显示,鸡白痢沙门菌spiC基因缺失株(S06004AspiC)符合我国转基因微生物安全评价的要求。本研究旨在构建鸡白痢沙门菌疫苗株种子库,对其进行全面检定,并选取工作种子库中菌种制备疫苗,进一步分析疫苗株的安全性和免疫效力。1.鸡白痢沙门菌疫苗株S06004ΔsiC种子库构建及其遗传稳定性分析疫苗作为一种生物制品,生产所用菌种必须以种子库的形式保存,防止菌株在传代培养过程中出现表型或基因型的改变。参照《中国兽药典》,依次构建了三级种子库(包括原始种子库、主种子库和工作种子库),并对各级种子库菌种进行全面检定,种子库中菌种纯粹,无杂菌。对种子库中菌种的培养特性、血清学特性、细菌形态、生化特性、目的基因、LD50和免疫原性进行检测,结果显示菌种的生物学特性、目的基因和免疫原性均未发生改变,毒力亦未返强;三级种子库中菌种经体内和体外连续传代25代后,所检测指标与原始疫苗株保持一致,这些结果表明三级种子库菌种的遗传稳定性良好。2.鸡白痢沙门菌疫苗株S06004AspiC安全性和免疫保护效力评估选取工作种子库中菌种制备疫苗,并对所制备疫苗的安全性和免疫保护效力进行全面系统的评估。疫苗株接种3 日龄雏鸡后,免疫组体重与空白对照组相比无显著性差异,但显著高于野生株感染组(P<0.05);免疫组雏鸡的肝脏、脾脏和盲肠未见任何组织病理变化,而野生株感染组雏鸡脏器病变严重;疫苗株在免疫组雏鸡肝脏、脾脏和排泄物中的定殖量显著低于野生株感染组(P<0.05),在肝脏中的定殖周期为21 d,在脾脏中定殖约28 d,在粪便中存留35 d,最终被机体清除;高剂量的疫苗株接种非靶动物(小鼠)未见任何临床症状和病理变化,表明疫苗株对非靶动物无致病性,亦不具有公共安全隐患。雏鸡攻毒保护试验表明,针对不同致病型鸡白痢沙门菌攻击,所制疫苗均能提供良好的免疫保护效力,达到90%以上,同时能有效地诱导机体清除强毒菌株的感染和定殖(P<0.05),针对鸡伤寒沙门菌和肠炎沙门菌的攻击可以提供60%以上的交叉保护能力。疫苗株免疫雏鸡14 d后血清抗体IgG和黏膜抗体IgA表达水平持续增高,显著高于对照组(P<0.01),表明疫苗株能诱导雏鸡产生良好的体液免疫和黏膜免疫应答;利用实时荧光定量PCR检测脾脏细胞因子的表达量,结果显示,在免疫初期免疫组IFN-γ和IL-2 mRNA的相对表达量显著高于野生株感染组(P<0.01),IL-1β的表达量在免疫早期先升高随后大幅度下降,在免疫后期IL-4和IL-10 mRNA的表达量显著增高(P<0.05),表明疫苗株能够刺激机体产生显著的细胞免疫应答。上述所有结果均表明所制备疫苗具有良好的安全性和免疫保护效力。