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目的:本研究的主要目的:1)采用超高效液相色谱-光电二极管阵列(UPLC-PDA)的新方法,对柴胡疏肝散复方中芍药内酯苷、阿魏酸、芍药苷、甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、水合橙皮内酯、新橙皮苷、异甘草素、甘草酸铵、a-香附酮和甘草次酸12种成分进行定量测定,为以柴胡疏肝散药材的主要成分及相关制剂的质量控制研究提供药学基础;2)采用超高效液相色谱-光电二极管阵列(UPLC-PDA)的新方法,对柴胡疏肝散复方体内成分进行定性测定,明确并分析该方在体内主要靶器官中的可吸收成分,初步探讨该方在体内发挥疗效的可能关键成分,为进一步药效学研究及新药的研发奠定理论基础。
方法:采用超高效液相色谱-光电二极管阵列(UPLC-PDA)测定的方法,以ACQUITY BEH C18柱(2.1mm×50mm,1.7um)为色谱柱,流动相为乙腈(A)-0.5%醋酸水(B,其PH3.5),梯度洗脱,成分的检测波长为190-480nm,洗脱程序为:5%A:95%B10min15%A:85%B20min30%A:70%B30min50%A:50%B40min70%A:30%B45min;流速为0.5ml/min,柱温为40℃,①定量测定柴胡疏肝散中芍药内酯苷、阿魏酸、芍药苷、甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、水合橙皮内酯、新橙皮苷、异甘草素、甘草酸铵、a-香附酮和甘草次酸12种成分,绘制这12种成分的标准曲线,并对其最低检测浓度、精密度、回收率、样本稳定性和重现性进行检测验证;测定并比较柴胡疏肝散水煎剂、商业颗粒1、商业颗粒2中12种成分的含量。②定性测定灌胃柴胡疏肝散后健康SD大鼠小肠和海马体组织中的有效成分;③定性测定服用柴胡疏肝散后抑郁症患者血浆的有效成分并作血浆提取方法的筛选。
结果:
1.UPLC-PDA法对柴胡疏肝散主要成分的检测
在不足41min的时间内,用梯度洗脱得到柴胡疏肝散汤剂中芍药内酯苷、阿魏酸、芍药苷、甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、水合橙皮内酯、新橙皮苷、异甘草素、甘草酸铵、a-香附酮和甘草次酸12种成分的色谱图,色谱图中各色谱峰分离完全,无杂峰干扰,提示该分析方法快速灵敏、准确可靠、稳定且重现性好。
2.柴胡疏肝散12种成分标准曲线的建立
①柴胡疏肝散中芍药内酯苷、阿魏酸、芍药苷、甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、水合橙皮内酯、新橙皮苷、异甘草素、甘草酸铵、a-香附酮和甘草次酸12种成分的标准曲线依次为:y=903.482x-138.12,y=21513.4x-817.05,y=866.86x-590.5,y=10422.6x-198.851,y=12813.2x-1670.41,y=13420.2x-1540.72,y=17166x-53.3246,y=15214.8x-5141.66,y=46924.8x-621.664,y=3949.3x+2091.42,y=10699.2x+2048.12,y=11538x+2794.88;其最低检测浓度(ug/ml)依次为1.44、0.038、2.16、0.046、0.024、0.026、0.033、0.025、0.016、0.759×10-3、0.124×10-3和0.166×10-3,在12种成分各自的线性检测范围内,12种成分标准曲线的线性回归(r2)均>0.997,提示12条标准曲线有良好的线性回归。
②12种成分的日间精密度的相对标准差(RSD)波动在1.25%-8.38%,日内精密度的相对标准差(RSD)波动在1.37%-9.39%.日间及日内精密度的相对标准差(RSD)均<10%,提示12种成分的标准曲线精密度良好。
③12种成分的回收率波动在93.8-100.6%之间,回收率相对标准差(RSD)波动在0.42%~4.17%,其回收率波动在90%-110%范围之内,且回收率相对标准差(RSD)均小于10%,提示12种成分回收率良好。
④柴胡疏肝散汤剂样本分别于0h、24h、48h的时间点进行检测,其样本稳定性实验的相对标准差(RSD)波动在0.28%~4.89%,其RSD值<10%,提示样本有很好的稳定性。
⑤12种成分的重现性实验的相对标准差(RSD)波动在1.31%-6.49%,均小于10%,提示12种成分的重现性良好。
3.在灌胃柴胡疏肝散汤剂后的健康SD大鼠小肠中定性测定出芍药内酯苷、阿魏酸、芍药苷、甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、水合橙皮内酯、新橙皮苷、异甘草素、甘草酸铵、a-香附酮和甘草次酸12种成分,说明柴胡疏肝散中的这12种成分能被健康SD大鼠小肠吸收;在灌胃柴胡疏肝散汤剂后的健康SD大鼠海马体中定性测定出中芍药内酯苷、阿魏酸、芍药苷、柚皮苷、橙皮苷、水合橙皮内酯、新橙皮苷、异甘草素和甘草酸铵9种成分,说明柴胡疏肝散中的这9种成分可透过血脑屏障,到达健康SD大鼠海马体组织;在口服柴胡疏肝散汤剂的抑郁症患者血浆中定性测定出柚皮苷、橙皮苷、水合陈皮内酯3种成分,提示柴胡疏肝散中的这3种成分能够被抑郁症病人胃肠吸收入血。
4.在对抑郁症患者服药后血浆提取方法筛选上,乙腈提取法的提取效果较甲醇和乙腈甲醇等量混合物这两种提取方法为佳。
结论:
1)超高效液相色谱-光电二极管阵列(UPLC-PDA)法对检测柴胡疏肝散中主要有效成分快速灵敏,准确可靠、稳定且重现性好。该方中的芍药内酯苷、阿魏酸、芍药苷、甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、水合橙皮内酯、新橙皮苷、异甘草素、甘草酸铵、a-香附酮和甘草次酸这12种成分标准曲线的建立,为柴胡疏肝散药材及药材相关制剂的质量控制研究提供了药学基础。
2)柚皮苷、橙皮苷和水合橙皮内酯这3种成分可能是柴胡疏肝散发挥疗效的关键成分
3)在对血浆进行处理的三种提取方法中,以乙腈提取方法提取效果为最佳。